褪黑素在预防和治疗肺癌中的辅助作用

刘苗苗 岳红梅,2 许金回 李雅亭 武兴东 朱浩斌

肺癌是最常见的恶性肿瘤,也是癌症相关死亡的重要原因。据估计,2020年约有220万新发病例和180万肺癌相关死亡病例,约占全球癌症病例总数的11.4%和癌症相关死亡病例总数的18%[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是肺癌的主要病理类型,手术切除和全身治疗是目前常用的治疗策略。但临床上很多肺癌患者在发现时已是晚期,手术机会渺茫,且全身治疗的局限性及副作用大,需要我们寻找与其他药物联合使用的新型有效抗癌疗法。近年来,很多研究聚焦于褪黑素(melatonin,MLT)在癌症中的作用。

MLT是一种吲哚胺类神经激素,在动物中,其合成始于色氨酸,在色氨酸羟化酶及芳香族氨基酸脱羧酶的作用下生成5-羟色胺(即血清素),而后生成N-乙酰-5-羟色胺,最后在羟基吲哚-O-甲基转移酶或乙酰-5-羟色胺-甲基转移酶作用下生成MLT[2]。MLT是一种亲脂性分子,很容易扩散到脑脊液及血液中,在血液中主要与白蛋白结合,小部分以游离形式存在,在肝脏中代谢为6-羟基褪黑素,随后通过尿液排泄[3]。在脊椎动物中,MLT可以直接或通过膜受体起作用,常见的膜受体有MT1、MT2和MT3。最近的研究发现MT1和MT2在NSCLC中的表达水平高于正常人,和腺癌相比鳞癌的表达水平更高,而且在NSCLC患者中MT2的高表达可能预示着预后较好[4]。研究表明MLT具有抗癌作用,但目前相关研究多在动物细胞试验水平上,临床研究较少(表1)。本文将从MLT对肺癌发生的影响、对癌细胞的抑制及与标准治疗方案的协同作用等方面说明MLT在肺癌,特别是在NSCLC中的辅助作用。

表1 褪黑素在癌症研究中的临床试验注册资料

一、MLT对肺癌发生的影响

肺癌的发病率逐年升高,吸烟是肺癌重要的致病因素之一。一方面,香烟烟雾含有多种成分,包括直接致癌物、毒素(如一氧化碳和尼古丁)以及氧化剂(如超氧化物和氮氧化物)等,这些物质可以造成肺组织损伤、肺部炎症以及氧化应激,进而引起癌变。另一方面,上述病变可以进一步引起基因突变和慢性阻塞性肺疾病,而这均是肺癌的重要危险因素[8]。此外,主动吸烟会降低人血液中的MLT水平[9],而MLT对肺癌的发生有一定预防作用,其机制可能有以下三种:(1)MLT有助于减少吸烟相关毒素对肺组织造成的损伤[10];(2)MLT可以减轻吸烟引起的肺部炎症[11];(3)MLT能够降低活性氧和过氧化脂质的产生,使谷胱甘肽和超氧化物歧化酶的活性增加,减少活性氧引起的DNA损伤,从而减少肺癌的发生[12]。亦有研究表明,昼夜节律紊乱导致MLT分泌受损的人患肺癌的风险增加[13],以上均表明体内MLT水平降低可能会增加肺癌发生的风险,MLT在预防肺癌发生的过程中发挥重要作用。

二、MLT对肺癌的抑癌作用

肿瘤的标志性特征这一概念最早在2000年由Hanahan和Weinberg提出并总结了6个核心特征。后随着对肿瘤的深入研究,在2022年第三版的Hallmarks of Cancer中,肿瘤的标志性特征已扩展为14个,即:持续增殖、逃避生长抑制、能够无限复制、抵抗细胞死亡、诱导血管生成、侵袭和远处转移、能量代谢改变、免疫逃逸、基因组不稳定和突变、炎症促发肿瘤、解锁表型可塑性、多态性的微生物组、衰老细胞、非突变表观遗传重编程[14]。

研究表明MLT作为辅助参与癌症的治疗有一定前景,可能涉及多种机制,如抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、改变代谢等[15],在肺癌中发挥作用的具体机制可能有以下几点:

1. 调节细胞周期,延迟肿瘤细胞进入有丝分裂

有丝分裂是真核细胞重要的增殖方式,而细胞持续增殖能力与癌症的发生和发展直接相关,所以调节细胞周期对于抑制肿瘤进展有重要作用。国内的一项研究表明大剂量MLT可能通过延迟肿瘤细胞进入有丝分裂(具体能够阻止细胞从G0/G1期进入到S期) 来抑制小细胞肺癌NCIH446细胞[16]。还有学者发现MLT联合顺铂可能通过调节细胞周期,促进顺铂诱导的人低分化肺腺癌细胞(SK-LU-1)凋亡来发挥抑癌作用[17]。

2. 逆转Warburg效应

在有氧条件下,肿瘤细胞优先选择糖酵解途径供能,而不是葡萄糖氧化磷酸化途径(即Warburg效应),这是许多癌细胞的特征[14],因此逆转Warburg效应对于抑制癌细胞的生长至关重要。一项研究探讨了MLT影响肺癌细胞生长的能力和线粒体功能与肺癌进展之间的关系。结果发现MLT可能通过刺激Sirt3增强丙酮酸脱氢酶(PDH)活性来提高线粒体膜电位和电子传递链中复合物Ⅰ和Ⅳ的活性,伴随着从胞质有氧糖酵解到氧化磷酸化的转变,这些变化使ATP产生增多,乳酸产生减少,进而逆转了Warburg效应[18],以抑制癌细胞的生长。

3. 抑制HDACs表达

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDACs)是从组蛋白和其他蛋白质中去除乙酰基的酶,可调节靶基因的表达。HDACs不仅参与染色质蛋白的脱乙酰作用,从而调控基因转录,还参与细胞凋亡、细胞周期进程和分化以及非组蛋白的脱乙酰化的过程[19]。Bcl-2以及Bcl-2家族成员Bax是细胞凋亡中作用于线粒体的关键调控分子,Bcl-2可以保护细胞膜通透性,抑制细胞凋亡,而Bax的作用与Bcl-2作用相反,通过调节细胞线粒体膜的通透性,促进细胞色素C的释放,激活级联反应,导致细胞凋亡[20]。有研究表明MLT可以通过抑制HDAC1信号通路,下调Bcl-2和GSH表达水平从而诱导细胞凋亡[21]。HDAC9低表达可以诱导细胞凋亡,显著抑制了癌细胞的生长,预后较好。Ma等[22]发现给予MLT治疗可以降低NSCLC的HDAC9水平,进而抑制增殖、转移和侵袭,促进细胞凋亡。

4. 增强Caspase活性

半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid-specific protease , Caspase)家族是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶。Caspase-3是其家族重要成员之一,是Caspase级联反应下游的关键凋亡执行者,Caspase-3的激活依赖于细胞色素C的释放,最终促进细胞凋亡。Caspase 9参与细胞凋亡的过程,可以促进多种癌细胞的凋亡[23]。有学者发现MLT可以增强Caspase-3活性并显著上调腺癌细胞中Bax、p53及凋亡调节因子和活性氧的表达,促进其凋亡。近年来有研究发现黄连素在治疗肺癌有一定价值,可以抑制肺癌细胞增殖、促进凋亡。然而有文献报道MLT联合黄连素治疗肺癌可以有效增强肺癌细胞对黄连素的敏感性。而且MLT还可以通过促进Caspase 9和多聚ADP-核糖聚合酶(PARP)的切割,增强Bcl-2的抑制作用,并触发细胞色素C的释放进而显著增加由黄连素诱导的细胞凋亡[24]。

上述为MLT抑制肺癌细胞生长、促进凋亡的相关机制,还有许多潜在的机制需要我们不断探索。越来越多的研究发现MLT在肺癌中还通过以下机制发挥抗转移作用:(1)抗血管生成。目前关于MLT抗肿瘤血管生成的研究较少,具体机制尚不清楚,可能与减少VEGF分泌相关。Lissoni等[25]发现晚期癌症患者口服MLT至少2个月后可以使VEGF分泌减少。Dai等[26]也证明了高浓度MLT抑制A549细胞内源性VEGF表达,从而发挥抗血管生成作用。(2)上调occludin 蛋白,增强肺泡细胞间紧密连接。Occludin 蛋白是第一个被发现的定位于紧密连接的跨膜蛋白, Zhou等[27]人报道褪黑素抑制A549细胞的迁移可能与OPN、MLCK、MLC下调以JNK磷酸化减少、细胞表面occludin表达和定位增强进而增强细胞之间紧密连接有关。(3)抑制上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)。EMT是一个复杂的过程,参与的转录因子包括Snail家族(Snail1、Snail2/Slug和Snail3)、Twist、β-catenin、锌指结合蛋白(ZEB1和ZEB2)和TCF3/E47/E12等。Chao等[28]研究发现MLT抑制EMT可能是因MLT可以通过 Wnt/β-catenin信号通路、PLC和p38/ERK通路进而抑制Twist/Twist1的表达。此外,也有研究表明在A549 细胞中,MLT可调节MMP-9和MMP-2活性,从而影响肺癌细胞基质的沉积,发挥抗肺癌细胞转移的作用[29]。综上所述,MLT可以抑制肺癌的生长、转移,有望为肺癌治疗提供新的机遇。

三、MLT对肺癌免疫调节的影响

免疫系统与癌症的相关性是一个动态而复杂的过程,涉及到它们之间相互调节。肿瘤微环境中包括各种免疫细胞和非免疫细胞,它们的活性和增殖在调节肿瘤对抗癌药物的反应中起着中心作用[30]。可以识别恶性细胞,诱导恶性细胞凋亡或坏死的抗肿瘤免疫细胞有NK细胞、CD8+T淋巴细胞、CD4+Th1细胞和M1巨噬细胞。MLT可促进单核细胞和Th1细胞释放IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12、IL-15和IL-27,然后刺激NK细胞增殖从而发挥抗肿瘤能力[31, 32]。

然而,MLT可能通过调节免疫发挥抗NSCLC的作用,有望作为NSCLC免疫治疗的辅助手段。据报道携带KRAS突变的NSCLC患者化疗疗效通常较差,且容易对免疫治疗产生耐药性,所以预后往往较差[33],因此需要探索新的治疗方法。Chao等[34]揭示了MLT可以下调KRAS突变型NSCLC中程序性死亡配体1(PD-L1)表达并调节肿瘤免疫,提出了MLT治疗KRAS突变型NSCLC的优势。在这项研究中,MLT显著降低了KRAS突变型NSCLC细胞系(包括A549,H460和LLC1细胞)的细胞活力,同时诱导癌细胞凋亡。其机制可能为携带KRAS突变的肺癌细胞表现出更高水平的PD-L1,但MLT治疗显著下调了PD-L1表达。另一方面,KRAS突变肺癌细胞表达较高的Yes相关蛋白(YAP)和具有PDZ结合基序(TAZ)水平的转录共激活因子,而PD-L1表达与肺癌细胞中的YAP和TAZ呈正相关。MLT处理有效抑制YAP和TAZ,伴有YAP/TAZ下游基因表达的下调。MLT和YAP/TAZ抑制剂的组合强烈降低了YAP和PD-L1的表达,进而减少肺癌细胞表面的PD-L1受体与T细胞表面的PD-1结合,减少免疫逃逸。综上,MLT可能对KRAS突变型NSCLC的治疗有一定作用,且有望作为辅助与抗PD-1等免疫疗法相结合,提高肺癌治疗疗效,为肺癌治疗设想了一种新的方法。

四、MLT和肺癌标准治疗的协同作用

随着包括胸部计算机断层扫描(computer tomography, CT)筛查在内的医疗技术的快速发展,早期肺癌的发现率较过去大大提高。早期肺癌通常与肺磨玻璃结节(ground-glass nodules, GGN)有关[35]。有相关研究报道对于具有多个GGN的早期肺癌,建议治疗方案如下:如果主结节直径为≥8 mm,建议切除主要病变并密切观察其他病变。如果主结节直径为<8 mm,建议随访[36]。虽然手术是早期肺癌的常用治疗方法,但对于具有多个GGN的早期肺癌,手术切除往往伴有其他结节恶化的问题。通常,患有多个GGN的患者面临多轮手术,这可能导致严重的肺功能损伤。也有指南推荐单独使用射频消融术(radiofrequency ablation, RFA)治疗早期肺癌,这可以有效地去除局部肿瘤组织,对肺的损伤小,但此方法治疗后,早期肺癌的复发率仍然较高[37]。最近,也有报道建议通过局部治疗与全身治疗(如靶向治疗、化疗和免疫治疗)相结合,可以减少复发[38]。然而,这些治疗具有明显的副作用,使得全身疗法不适合用于具有多个GGN的早期肺癌。为了解决上述问题,有学者进行了相关研究,发现与目前的一线手术治疗相比,局部RFA联合MLT治疗具有多个GGN的早期肺癌不仅可以有效地抑制未消融的GGN发展,还可以解决单独使用MLT时对肿瘤负荷较大的患者疗效有限的问题;其机制可能是由于MLT通过MAPK、NF-κB、Wnt、Hedgehog途径和p53途径抑制肿瘤生长,RFA和MLT联合治疗增强了NK细胞的活性和氧化磷酸化[5]。而且根据他们的随访数据发现,与手术组相比,RFA + MLT治疗后肿瘤进展的风险显著降低。

表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor, EGFR -TKIs)已成为晚期NSCLC的标准治疗方法,EGFR突变阳性的NSCLC患者服用EGFR -TKIs类药物可以获得很好的治疗效果,但也有很多患者因产生了耐药性,治疗效果往往不理想。所以很多学者一直在努力寻找其他治疗方法,如寻找可以克服EGFR -TKIs耐药的药物,或将EGFR-TKIs和其他药物联用。奥希替尼是第一种为克服耐药性而开发的EGFR -TKIs,其可以克服因EGFR T790M突变引起的耐药[39]。有研究报道提高EGFR突变NSCLC患者疗效的另一种策略是将EGFR-TKIs与抗VEGF药物联合使用[40]。然而令人激动的是常被用来调节睡眠、与其他抗VEGF药物相比毒性较小即使长期服用也仅会带来轻微副作用。MLT有望成为一种抗VEGF药物与EGFR-TKIs联合治疗NSCLC的药物,其机制有以下几点:(1)MLT可防止HIF-1α易位到细胞核中,从而阻碍VEGF表达,并防止HIF-1α、磷酸化-STAT3和CBP / p300复合物的形成,进而引起血管生成相关基因的表达。(2)MLT的血管抑制特性也可能是由于其抑制VEGFR2活化和表达的能力[15]。因此,MLT在肺癌治疗中的辅助作用不容忽视。

五、总结与展望

肺癌发病率居我国恶性肿瘤首位,给社会和患者带来巨大的经济负担。在过去几年中随着分子靶向药物和免疫检查点抑制剂的应用,治疗上虽取得了许多进展,但是肿瘤耐药、易复发以及全身治疗不良反应重的难题仍没有解决,需要我们不断探索有效、安全的治疗药物。MLT是一种常用于治疗睡眠障碍的多效性激素,毒性最小,具有抗癌作用。本文说明了MLT促进肺癌癌细胞凋亡、抑制其生长和转移的具体机制,并探讨了MLT与RFA、免疫检查点抑制剂和EGFR -TKIs联合抗癌的可能性,为肺癌治疗提供了一个新的方向。然而,目前的研究有限,仍需要更多的动物细胞试验探索MLT发挥抗癌作用的分子机制及更多的临床研究来证实MLT在肺癌治疗中的价值。