奶山羊乳房炎主要致病菌的分离鉴定及防治措施

白庆玲，王 斌

1 沂水县动物疫病预防控制中心，山东临沂 276400

2 沂水县道托畜牧兽医工作站，山东临沂 276400

0 引言

随着人民生活水平提高，乳制品需求的加大促进了我国现代畜牧业的快速发展，尤其是奶山羊养殖。奶山羊是一种广泛分布于全球的家畜，因其适应性强以及抗逆能力强等特点，成为养殖户选择的重要品种之一，其乳制品以独特口感和营养价值备受人们喜爱。我国奶山羊主要品种为关中奶山羊、崂山奶山羊、萨能奶山羊和文登奶山羊。我国山羊存栏量约为14 000 万头，其中奶羊约为900 万头，山羊奶产量约为200 万吨，占全国鲜奶总量的5%左右[1]。虽然我国是世界上山羊存栏量较多的国家之一，但奶山羊单产却低于欧洲国家。影响山羊产奶量的因素有很多，其中奶山羊乳房炎在世界范围内发病率较高，对奶制品质量和产量带来极大影响。奶山羊乳房炎不仅导致奶质量下降，还增加治疗成本，给养殖业带来重大经济损失。奶山羊乳房炎是由多种病原菌引起的乳腺感染，常见病原菌主要有金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌等，其产生的毒素会导致奶质变坏、食用后中毒等问题。因此，及时发现并准确鉴定病原菌，采取合适的奶山羊乳房炎防治措施非常关键。合理预防和治疗，可有效降低奶山羊乳房炎发生率和对养殖业的危害性。本试验通过对山东临沂地区某奶山羊养殖场乳房炎主要致病菌的分离鉴定及其药敏性分析，探究其防治措施，为奶山羊乳房炎预防和治疗提供理论基础和技术支持。

1 试验材料

1.1 试验动物与地点

本试验地点是山东临沂地区某奶山羊养殖基地，奶山羊品种为优质萨能奶山羊。为确保试验的准确性和可靠性，仅选择处于泌乳早期且已排过初乳的成年萨能奶山羊，以避免可能由于新陈代谢影响而引起偏差。

1.2 主要试剂及仪器

胰蛋白胨、酵母提取物、犊牛血清、血琼脂培养基、药敏纸片，购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；革兰氏染色液试剂盒、核酸染料、血琼脂培养基、MH固体培养基、高盐甘露醇固体培养基、伊红美蓝培养基、麦康凯培养基，购自北京索莱宝科技有限公司；青霉素G、克林霉素、红霉素、四环素、氯霉素、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、头孢唑林、头孢呋辛、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、氯化钠，购自上海麦克林生化科技股份有限公司；恒温培养箱、恒温摇床，购自上海南荣实验室设备有限公司；JY02S型凝胶电泳紫外分析仪、JY300C电泳仪、PCR仪，购自美国捷迈邦美公司（Zimmer Biomet，USA）。

2 试验方法

2.1 样品采集

试验采集患有临床型乳房炎的奶山羊乳样。通过对养殖场奶山羊乳房进行视诊和触诊，筛选出乳房外观肿胀、充血、发热，或乳房呈坚硬或结节状的奶山羊，对乳汁进行肉眼观察，一般患乳房炎奶山羊分泌的乳汁外观浑浊，且含有脓液或血液。

采样前需将奶山羊乳房清洁干净，使用碘伏和棉球擦拭乳头及周围皮肤，保持清洁干燥。用手轻轻按压乳房，让乳汁流出，弃前3 把奶后，将乳汁采集器贴紧乳头部位，轻轻旋转采集器，使其充分贴合乳头周围皮肤，收集5 mL乳汁于无菌离心管中，做好标记并使用冰袋运输至实验室进行细菌分离和鉴定，共收集46 份乳汁。

2.2 奶山羊乳房炎病原菌分离鉴定

将收集的乳汁反复摇匀后取100 µL涂布接种于血琼脂培养基，在培养箱恒温37 ℃条件下培养24 h后，取形态呈现不同特征的单个菌落，使用划线平板法分别接种于MH固体培养基、高盐甘露醇固体培养基、伊红美蓝培养基、麦康凯培养基，反复纯化培养直至呈现单一菌落形态以达到完全分离效果。

使用水煮法提取各种分离出来的菌株DNA，将菌株使用细菌单克隆培养液离心沉降后，使用超纯水洗涤1次，然后加入超纯水煮沸15 s后立即将管子置入冰水降温，使细胞壁破裂，将DNA释放到溶液中。最后2 000 r/min离心5 min，收集上清液中DNA作为模板，放入-20 ℃冰箱储存。相关病原菌的引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成，使用细菌16S rDNA引物进行 PCR反应，将配制好的DNA模板、引物、聚合酶和缓冲液混匀，离心后放入PCR仪中，将PCR反应体系加热至95 ℃预变性5 min，使DNA双链解旋成单链，随后设置95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，以便引物与DNA单链结合，最后将PCR反应体系温度升高至72 ℃进行延伸1 min。按上述步骤从95 ℃预变性5 min开始进行35 个循环后，于72 ℃条件下延伸5 min，即可得到PCR扩增产物，最后将扩增产物送至广州锐博生物技术有限公司进行测序，并与GenBank数据库中收录序列进行比对，确定细菌种属。

2.3 主要病原菌药敏性试验

使用Kirby-Bauer 纸片扩散法进行病原菌药敏性试验，主要测试金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌。将分离纯化好的单克隆菌落置于适量生理盐水中，浓度设置为约1.5×108CFU/mL。用无菌一次性滴管把不同种类的抗生素液滴在药敏试验纸片上，让其充分渗透并固定，在4 mm厚度琼脂平板表面均匀涂上细菌悬液，然后用无菌镊子夹取涂上抗生素的药敏试验纸片，将其贴在琼脂平板表面，使纸片与细菌悬液充分接触，将琼脂平板倒置在恒温培养箱进行培养，条件设置为37 ℃、24 h。最后测量出现的无菌区域，并与赛默飞世尔科技（中国）有限公司提供的抗生素敏感性标准比较，判断该菌株对各种抗生素的敏感性，本试验将中间范围也归为耐药标准范畴，具体判定标准见表1。

表1 药敏试验判定标准

3 试验结果

3.1 奶山羊乳房炎病原菌分离鉴定

从山东临沂某奶山羊养殖场采集的46 份乳样中，通过细菌培养法分离后得到109 株细菌，使用PCR技术扩增后将样品送至广州锐博生物技术有限公司进行测序对比确定种属，结果如表2所示。其中葡萄球菌51 株，占46.79%；埃希菌45株，占比41.28%；克雷伯氏菌8 株，占7.33%；肠球菌、芽孢杆菌、酪氨酸链球菌占4.59%。本试验结果表明，该山羊养殖场主要致病菌为葡萄球菌中的金黄色葡萄球菌（28.44%）、大肠埃希菌（41.28%），从细菌种类上呈现致病菌多样化，说明该山羊养殖场存在多种细菌混合感染的情况。

表2 奶山羊乳房炎病原菌分离、鉴定结果

3.2 主要病原菌药敏性

通过Kirby-Bauer 纸片扩散法测定不同抗菌药物对大肠杆菌的影响程度。将乳样进行细菌培养并对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌分离，对得到的67 株金黄色葡萄球菌、84 株大肠埃希菌进行试验，结果如表3所示。其中从乳汁中分离出的金黄色葡萄球菌对环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、头孢噻肟钠、头孢呋辛、链霉素具有较高敏感性，对青霉素G、克林霉素、庆大霉素和卡那霉素具有较高耐药性。而大肠埃希菌对青霉素G、克林霉素、红霉素、链霉素具有较高耐药性，对诺氟沙星、氧氟沙星、庆大霉素、卡那霉素具有较高敏感性。综合分析发现，2 种致病菌对青霉素G和克林霉素均具有较高耐药性，而2 种致病菌对沙星类药物具有较高敏感性。

表3 2 种病原菌药敏试验

4 分析与讨论

4.1 奶山羊乳房炎病原菌分离鉴定

细菌感染是奶山羊患乳房炎的最主要原因之一，近年来国内许多研究多关注奶牛乳房炎，而奶山羊乳房炎研究较少。奶山羊乳房炎的致病菌种类相对于奶牛较少，其中葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌这3 种细菌占总致病菌的90%以上。

大肠埃希菌是一种常见致病菌，也是多种畜禽细菌性疾病的最主要致病菌。奶山羊感染大肠埃希菌后，开始会出现乳腺炎症，后出现全身性疾病症状，导致脱水甚至死亡。有研究对玉林市奶山羊乳房炎病原菌种类进行探索，结果发现主要致病菌为葡萄球菌和肠球菌，占比分别为61.5%和23.1%[2]。郑风英研究表明，滨州市奶山羊临床型乳房炎结果发现主要致病菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、无乳链球菌，占比分别为34%、29.8%、12.8%[3]。本试验结果表明，分离鉴定得到109 株菌株中最主要致病菌是金黄色葡萄球菌（28.44%）、大肠埃希菌（41.28%）。造成不同结果的原因可能是地域、饲养管理等差异导致主要致病菌种类有较大差异。

4.2 奶山羊乳房炎的治疗方法

虽然近年来关于奶山羊乳房炎治疗方法的探索研究有很多，但现实应用中绝大多数养殖场还是选择抗生素治疗。20世纪40年代最开始临床使用的抗生素主要是青霉素和土霉素，这些抗生素可通过注射或口服给药，但由于奶山羊使用后的乳汁中存在药物残留，导致人们对这种方法产生担忧。后续新药研发和使用新的抗生素如庆大霉素、四环素、链霉素等开始应用于治疗奶山羊乳房炎，这些抗生素在乳汁中的残留时间较短，对奶制品安全更有保障。

随着抗生素广泛应用，乳房炎治愈率明显提高，但抗生素滥用也导致细菌耐药性问题，其中青霉素、克林霉素和广谱抗菌类四环素中的土霉素临床使用时间较长，几乎大部分细菌都对土霉素具有不同程度的耐药性。头孢菌素类药物是广谱抗生素，其中第3、4代头孢菌素如头孢噻肟钠、头孢曲松钠等广泛应用于兽医临床治疗，具有较好抗菌效果。氟喹诺酮类抗生素如环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星，尤其是恩诺沙星为广谱抗菌，且与其他抗菌药显现出较小的交叉耐药性，因此对耐药性致病菌有特别的治疗效果[5]。本试验中药敏试验显示，该奶山羊养殖场中引起乳房炎的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌对青霉素、克林霉素几乎完全耐药，而对氟喹诺酮类抗生素、头孢菌素类抗生素均较敏感，因此在日常奶山羊乳房炎的治疗中可选择这两种药物，但须合理用药，科学治疗，避免细菌耐药而出现超级细菌。另外，不同地区养殖场的细菌耐药程度、种类不同，在治疗奶山羊乳房炎之前应进行简单药敏试验，确定其耐药和敏感的药物种类，对症下药。

4.3 奶山羊乳房炎的预防

奶山羊乳房炎的主要病因是细菌感染，因此最主要的预防措施首先是保证羊圈卫生，避免饲养环境阴暗潮湿和污秽，进而抑制病原菌滋生和繁殖。其次，挤奶操作时，器械和容器都需消毒灭菌，操作要规范，挤奶操作不当将导致奶山羊乳房组织损伤。最后，要关注奶山羊日常饲养管理，做到科学饲养。饲料搭配均衡，适当添加营养元素，提高奶山羊自身免疫能力。

另外，奶山羊乳房炎存在多种致病菌混合感染，应针对主要致病菌的综合性预防措施为主。国内有不少针对金黄色葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌研发成功的疫苗[4]。针对金黄色葡萄球菌的疫苗可细分两大类，一类是以全菌减毒灭活疫苗和菌体裂解液为代表的包含所有病原体的疫苗，另一类是以多糖分子为主的病原体亚单位疫苗。一般前者疫苗的免疫效果要优于后者，但是后者可降低潜在副作用，因此需根据特定情况选择合适疫苗。

5 结论

本试验结果表明，该养殖场乳房炎细菌性病原主要是金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌，体外药物敏感性测试结果显示该养殖场的两种主要致病菌对喹诺酮类和头孢菌素类抗生素较敏感，推荐临床使用治疗。