苹果枝烘烤鸡蛋的理化性质、微观结构和蛋白组成的变化研究

周 宁, 韩东晶, 王志花, 汪文君, 杨少华, 刘国庆

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

鸡蛋营养成分丰富,不仅包括蛋白质和脂类,还包括硫胺素、核黄素、维生素A、B、D、E等多种维生素和钙、磷、钾、钠、镁、铁、锌等矿物质[1]。鸡蛋是优质蛋白质和必需营养素的主要来源,它提供许多理想的功能属性,如发泡、乳化、凝胶、着色、调味[2],有助于食品的质地特性。我国是消费鸡蛋最多的国家,但目前消费形式单一,对鸡蛋制品的深度加工程度较低。蛋制品的种类并不丰富,在中国餐桌上受欢迎是传统的蛋制品,如皮蛋、咸蛋、酒蛋等。这些蛋制品耗时长,用强碱腌制会导致皮蛋中大量赖氨酸、丙氨酸等的形成,降低蛋白质的营养价值,对人体健康造成潜在的危害[3]。为了延长加工鸡蛋的货架期,同时提高其利用价值,亟待探索新的鸡蛋加工方法和工艺。

苹果枝条富含纤维素、半纤维素和木质素,除此之外还含有多酚类化合物,其中苹果多酚具有抗氧化、保鲜、抗肿瘤等功效。酚类化合物易与蛋白质结合并对其结构进行修饰,从而改变蛋白凝胶的物理性质[4],修剪后的苹果枝条作为农业副产物,经常被丢弃或焚烧,从而造成宝贵资源的浪费,甚至污染环境[5]。为促进果园废弃物的资源综合化利用,本文利用苹果枝烘烤鸡蛋(apple branches treated baked eggs,ATBE),同时对成品蛋的品质特性、微观结构及组分分析进行研究,为蛋制品加工工艺方法的拓展和农业废弃物的高值化利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜鸡蛋(50～60 g)购于合肥市经济技术开发区大润发超市;苹果枝条购于陕西咸阳;无水乙醇、甲醇、2.5%的戊二醛、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)、光谱级溴化钾(KBr)均购于阿拉丁试剂(上海)有限公司。

多功能粉碎机(永康市红太阳机电有限公司);GZX-9030MBE电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司);H/T16MM台式高速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司);Vertex70型傅里叶变换红外光谱仪(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)(德国布鲁克公司);TAXTplus物性测试仪(英国Stable公司); FD-1-50 Plus真空冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);Agilent HP7890-5975C型气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦科技公司);F98荧光分光光度计(上海棱光技术有限公司);SU8020冷场发射扫描电子显微镜(field emission scanning electron microscope,FESEM)(日本); UltiMate 3000 RS色谱仪、Q Exactive 高分辨质谱仪(high-resolution mass spectrometry,HRMS)(赛默飞世尔科技有限公司;JP-040S超声波清洗器(深圳洁盟清洗设备有限公司);磁力加热搅拌器(德国IKA公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 烤鸡蛋的准备

将晒干的苹果枝条使用多功能粉碎机粉碎,过40目筛子。将新鲜鸡蛋清洗干净,用如下方法得到2种鸡蛋:在食品级烧杯里放入鸡蛋和苹果枝条粉末于烘箱100 ℃烘烤数小时,即苹果枝烤鸡蛋ATBE;将放在食品级烧杯里的鸡蛋置于烘箱100 ℃烘烤数小时,即烘烤蛋(baked eggs,BE)。2种鸡蛋都在烘箱里烘烤12～20 h,每隔2 h取出样品。

1.2.2 质构的测定

使用TAXTplus 物性测试仪测定[6],但略有修改。烘烤的鸡蛋样品用手术刀切成立方体(10 mm×10 mm×10 mm),进行质地剖面分析(texture profile analysis,TPA)。用压缩P/36R圆柱探针圆柱形探头将制备好的样品压缩2次,压缩比为 60%,触发力为5 g,环境温度为25 ℃,测试前、后速度分别为1.0、2.0 mm/s,恢复时间为5 s。实验重复5次,取其平均值。

1.2.3 蛋壳的微观结构测定

按照文献[7]测定烘烤鸡蛋蛋壳的微观结构。分别取BE、ATBE的半个蛋壳,把蛋壳膜撕掉,用蒸馏水清洗每片蛋壳的内外表面,放在红外干燥灯下至干燥;用手术刀沿垂直于蛋壳表面切取长约50 mm、宽30 mm的块状样品,将其用导电胶粘于样品台上,喷金后放在电镜下进行观察拍照。

1.2.4 蛋白的微观结构测定

参照文献[8],取BE、ATBE中间部分的蛋白,将凝胶样品中心部位切成小块,用2.5%的戊二醛溶液浸泡固定,4 ℃条件下放置4 h。固定好的样品在室温条件下用磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L、pH值为7.0)漂洗3 次,每次10 min,分别将其用体积分数梯度为10%、30%、50%、70%、90%、100%(2次)每次5～10 min的乙醇溶液进行逐级脱水,脱水过程中轻微摇晃,脱水后的样品冻干。干燥后的样品用导电双面胶固定到样品台上,经溅射仪喷金后拍照观察。

1.2.5 荧光光谱测定

使用8-苯基-1-萘磺酸荧光探针方法测定鸡蛋白蛋白质样品的表面疏水性,在文献[9]研究的基础上,用磷酸盐缓冲液(50 mmol/L、pH值为7.0)分别将样品稀释到0.5 mg/mL,荧光探针稀释到8 mmol/L,然后取20 μL的荧光探针加入到4 mL样品稀释液中。在黑暗中,25 ℃下孵育15 min,在25 ℃下进行荧光扫描。 激发波长和发射波长分别设定为380 nm和400～600 nm。发射和激发波长的狭缝均为5 nm。

1.2.6 FTIR

在红外干燥灯下将干燥的1 mg鸡蛋白粉末与200 mg纯KBr在玛瑙研钵中充分研磨,在压片机上压成透明薄片,以空气为背景,在分辨率为4 cm-1,扫描32次,在4 000～400 cm-1波数范围内测定其红外光谱。

1.2.7 蛋白的化学物质测定

1.2.7.1 样品处理

称量冻干后的样本约200 mg,加入 1 mL的甲醇和1 mL的水,涡旋混匀。加入 2～3 颗二氧化锆研磨珠,研磨提取 3 min;4 ℃条件下离心10 min,上清液用 0.22 μm 滤膜过滤,取滤液上机分析。

1.2.7.2 条件

1) 质谱条件。电喷雾离子源(electrospray ionization,ESI)的电压为3.8 kV,毛细管温度为300 ℃,采用正负离子切换扫描,扫描范围为100.0～1 500.0 m/s,检测方式Full Mass/dd-MS2。碰撞气为高纯氩气(纯度≥99.999%);鞘气为氮气(纯度≥99.999%),相对压力为40;辅助气为氮气(纯度≥99.999%),350 ℃。数据采集时间为30 min。

2) 色谱条件。色谱柱为RP-C18 150 mm×2.1 mm,1.8 μm),检测方式为Full Mass/dd-MS2,流速为0.30 mL/min,水相为0.1%甲酸水溶液,有机相为0.1%甲酸乙腈,洗针液为甲醇,柱温箱温度为35 ℃,自动进样器温度为10 ℃,进样针高度为2.00 mm,自动进样器清洗设置为Both,自动进样器洗针体积为200.00 μL。自动进样器进针清洗时浸泡时间为3.00 s,自动进样器进样体积为5.00 μL。高分辨液质采集的数据通过 CD 2.1(Thermo Fisher)完成数据初步整理后进行数据库检索比对(mzCloud数据库、 mzVault数据库、 ChemSpider数据库)。

1.2.8 数据统计分析

每个单独实验至少重复3次,所有实验数据均以(平均值±标准差)表示,并利用SPASS 17.0软件进行数据统计处理,采用ANOVA进行不同试验组间的邓肯差异分析(P<0.05),采用Origin 2019软件绘制数据图。

2 结果与分析

2.1 蛋白的质构分析

蛋白凝胶从8～20 h的质构变化如图1所示。从图1可以看出,随着烘烤时间的延长,BE和ATBE硬度迅速增加(P<0.05),分别从3 272.23、2 530.05 增加到5 346.49、4 659.64,与BE相比,苹果枝使蛋白硬度降低(P<0.05)。 弹性反映产品在第1次压缩变形后的物理回弹情况,BE和ATBE在烘烤过程中弹性先升高再缓缓降低,在16 h后,BE和ATBE的弹性基本保持一致。说明苹果枝对蛋白凝胶的质构产生了影响,与BE相比,在16 h前蛋白的弹性增加(P> 0.05),说明蛋白之间的相互作用增强。高弹性说明蛋白聚集程度高、凝胶网络结构[10]紧密。因此16 h的蛋白具有良好的硬度、弹性和相对优良的食用性能,与文献[11]的结论一致。

图1 蛋白的硬度和弹性变化

2.2 鸡蛋微观结构分析

通过FESEM可以观察样品的微观结构,BE、ATBE蛋壳的FESEM图如图2所示。从图2可以看出,两者气孔的数目均很多,但是图2b相比图2a,蛋壳的外观结构更疏松多孔,可能在持续高温下,苹果枝里的部分多酚酸类物质与鸡蛋壳中的碳酸钙发生反应,腐蚀蛋壳,使蛋壳表面变得稀松多孔。BE、ATBE蛋白的FESEM如图3所示,从图3a可以看出,蛋白凝胶网络结构连续性差,不均匀。从图3b可以看出,蛋白凝胶结构更致密规则,间隙小,较光滑,形成细凝胶束。这可能是由于苹果多酚含有的活性羟基与蛋白主链或侧链上的活性基团发生了交联作用,增强了氢键进而形成更加均匀的网络结构,结构越均匀致密,其凝胶性越好,这与文献[12]的研究结果一致。FESEM显示出一些颗粒状的物质,这可能是天然物质(苹果多酚)与蛋白质结合的结果。

图2 BE、ATBE蛋壳的FESEM图

图3 BE、ATBE蛋白的FESEM图

2.3 表面疏水性变化分析

蛋白的表面疏水性如图4所示。

图4 蛋白的荧光光谱图

苹果枝处理后蛋白的表面疏水性降低,表明蛋白质发生聚集,这种聚集保护了蛋白质的疏水区域,这种现象的发生可能是由于添加了苹果枝鸡蛋白的蛋白质被展开,暴露出蛋白质分子内部的疏水氨基酸残基[13]。部分暴露的疏水氨基酸通过疏水键与多酚交联或蛋白质重新聚合[14]。此外,蛋白质的聚合和蛋白质与多酚的交联可以产生更多的大分子,这些大分子的聚集有助于增强凝胶结构,这也是ATBE凝胶强度增加的原因。

2.4 二级结构分析

通过FTIR分析苹果枝对蛋白二级结构的影响,蛋白的二级结构如图5所示,图5中不同字母表示显著性差异。

图5 蛋白的二级结构分析

在3 200～3 400 cm-1的特征吸收波段分别是—OH和—CH基团的伸缩振动[15]。蛋白在3 200～3 400 cm-1处出现吸收峰,ATBE比BE的吸收峰更高、更宽,说明分子间和分子内存在较强的氢键。使用PeakFit 4.12软件对蛋白在酰胺Ⅰ波段(1 700～1 600 cm-1)的FTIR光谱数据进行基线校正、高斯反褶积和二阶导数拟合。FTIR通常根据蛋白质在酰胺Ⅰ区(1 700～1 600 cm-1)的吸收情况对蛋白质二级结构进行分类。峰分布如下[16]:1 600～1 640 cm-1为β-折叠;1 640～1 650 cm-1为无规卷曲;1 650～1 660 cm-1为α-螺旋;1 660～1 700 cm-1为β-转角。ATBE的β-折叠所占百分比最高,其次是β-转角、α-螺旋和无规卷曲,而BE的β-转角所占百分比最高。ATBE和BE的无规卷曲和α-螺旋基本上不变。ATBE相比BE,β-折叠显著增加(P<0.05),β-转角(P<0.05)显著降低。β-折叠结构表明强大的氢键相互作用,这是维持蛋白质二级结构的主要力量,其含量增加表明分子间氢键作用增强[17],导致蛋白质分子间聚集程度增加。在简单持续的高温和苹果枝共同作用下,β-折叠有助于凝胶网络结构的增强和弹性,使凝胶结构更加致密。综上所述,苹果枝能使蛋白的凝胶结构更紧凑和富有弹性。这一变化充分说明苹果枝对蛋白质二级结构有一定的影响。

2.5 蛋白化学成分测定

每组样本的数据由正电离模式中超高效液相色潽-四极杆-静电场轨道井高分辨质谱(ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole-orbitrap high-resolution mass spectrometry,UPLC-Q-Orbitrap HRMS)系统获得。ATBE和BE分别检测到146、85个物质。其中有59种鸡蛋所共有的物质,87个与对照组显著不同,根据峰的精确质量和碎片模式,结合文献和数据库进行鉴定,筛选出蛋白化学成分的多酚化合物,见表1所列。

表1 蛋白多酚类物质的UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析

苹果多酚主要由黄酮类化合物、黄酮酚、异黄酮、二羟基葡聚糖和其他酚醛酸组成[18]。根皮素是苹果多酚普遍存在的一种天然二氢查尔酮类黄酮,主要分布于苹果、梨等多汁果皮或根皮中。根皮素具有多种药理特性,如抗糖尿病、抗氧化、抗炎和抗肿瘤活性[19]。

通过分析FESEM、表面疏水性以及二级结构的变化,推测蛋白中的多酚是多酚进入蛋白并与蛋白结合,从而对蛋白产生了影响。

3 结 论

在苹果枝的存在下,烘烤鸡蛋的理化性质、微观结构和蛋白组成发生了显著变化。与苹果枝共同烘焙,可以有效改善鸡蛋的质地,使鸡蛋的弹性增加,硬度下降,蛋白凝胶变得光滑致密。在烘焙过程中,ATBE的蛋壳气孔数量增加,多酚类物质进入蛋白中,表面疏水性降低以及氢键作用增强,该现象表明苹果枝中的多酚酸等活性物质通过蛋壳孔和蛋壳膜进入鸡蛋中,通过氢键和疏水作用与鸡蛋中的蛋白质结合,促进了蛋白的聚集。本文的研究为苹果多酚在食品中的应用奠定了基础,提高了苹果多酚的功能性和适用性。