白玉菇多糖理化性质及免疫活性研究

唐方媛, 张娅娣, 刘 咏, 王军辉,3

(1.合肥工业大学 农产品生物化工教育部工程研究中心,安徽 合肥 230601; 2.合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601; 3.合肥工业大学 安徽省农产品精深加工重点实验室,安徽 合肥 230601)

0 引 言

食用菌指子实体硕大、可供食用的大型真菌[1],因独特的风味、营养及保健功能受到研究人员的广泛关注。多糖是真菌发挥生理活性的重要活性物质[2],是细胞壁的组成、能量储备的细胞内包涵体和细胞外用于保护细胞的附着物[3],在增强免疫、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等方面具有显著的药理学功效[4-7]。多糖作为天然免疫调节剂,通过激活补体系统和免疫细胞,促进多种细胞因子的释放从而诱导免疫调节活性[8],成为功能食品和药物领域的研究热点。巨噬细胞是参与机体免疫的一种重要效应细胞,在先天性和适应性免疫反应中可发挥吞噬、呈递抗原和分泌细胞因子等作用[9]。

白玉菇又名白玉蕈(whiteHypsizygusmarmoreus),属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、玉蕈属,是真姬菇的一种稳定白色变异体菌株[10]。其色泽剔透,口感优越,深受消费者青睐。白玉菇富含多种维生素和矿物质,多糖质量分数达7.50%,高于其他食药用菌(如香菇、猴头菇、竹荪、金耳、猪苓等),是一种高蛋白、低脂肪的功能性食品[11]。研究表明,具有较好生物活性的真菌提取物大多来自担子菌纲和子囊菌纲[12]。因此,对白玉菇多糖进行生物活性的研究具有重要意义。

本文对白玉菇子实体多糖进行多层次提取,在分离纯化的基础上通过药理学模型,研究白玉菇多糖对巨噬细胞增殖、吞噬能力和NO释放量的影响,评价其对机体的免疫活性,筛选出较优的活性组分,为深入研究白玉菇多糖免疫调节机制以及开发多糖资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜白玉菇子实体购于安徽省合肥市某大型市场;无水乙醇、正丁醇、三氯甲烷、三氟乙酸、硼氢化钠、氯仿等均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司;DEAE-Cellulose购于索莱宝科技有限公司;DMEM培养基、脂多糖、胎牛血清购于Hyclone公司;NO检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

酶标仪(Thermo Fisher Scientific公司);旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司);冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司);气相色谱仪(Agilent公司);CO2培养箱(日本三洋电机株式会社)。

1.3 白玉菇多糖的提取

新鲜白玉菇子实体经冷冻干燥后,使用高速药品粉碎机粉碎,过200目筛后置于索氏提取器中在90 ℃无水乙醇脱色脱脂24 h,烘干备用。

白玉菇粉末以1∶20的料液比在0.9%氯化钠溶液常温提取12 h,重复提取3次。提取液离心去除不溶物,上清液浓缩后用Sevag试剂脱蛋白,重复数次后取分液漏斗上层溶液减压蒸馏,除去有机溶液。浓缩液用30% H2O2脱色后于流水和去离子水中分别透析3 d,透析液冻融离心后冷冻干燥得到白玉菇常温水提多糖(WHN)。

常温提取残渣以1∶20的料液比在0.9%氯化钠溶液100 ℃提取2 h,离心除去不溶物,重复提取2次。上清液经浓缩、脱蛋白、脱色、透析和冻融后冷冻干燥得到白玉菇沸水浸提多糖(WHB)。

称取120 mg白玉菇多糖溶解于10 mL去离子水中,离心后用移液管将上清液缓慢滴加到预装完成的DEAE-Cellulose阴离子交换层析柱(3.0 cm×40 cm)中,依次用不同浓度的氯化钠溶液(0、0.1、0.2 mol/L)逐步洗脱,流速2 mL/min。自动收集洗脱液(10 mL/管),并通过苯酚-硫酸法测定多糖质量分数。收集多糖质量分数高的峰,冻干得到纯化多糖。

1.4 白玉菇多糖的理化性质测定

总糖质量分数采用苯酚-硫酸法[13]测定其在490 nm处的吸光度,以葡萄糖为标准品,根据建立的标准曲线计算样品中总糖质量分数。

蛋白质质量分数采用考马斯亮蓝法[14]测定其在595 nm处的吸光度,以牛血清白蛋白为标准品,根据标准曲线计算样品中蛋白质质量分数。

糖醛酸质量分数采用间羟基联苯法[15]测定其在520 nm处的吸光度,以半乳糖醛酸作为标准品,根据标准曲线计算样品中糖醛酸质量分数。

根据文献[13]的方法稍作修改进行单糖组成分析。取5 mg待测样品置于安瓿管中,加入三氟乙酸110 ℃水解4 h后,减压蒸干。将完全水解后的样品在NaBH4水溶液中还原3 h,25%的醋酸溶液中和后减压蒸干,于115 ℃烘箱中干燥20 min。加入等体积的乙酸酐和吡啶,在密封条件下100 ℃反应1 h。减压蒸干至有粉末物质出现,加入适量的氯仿和去离子水,萃取至水层澄清。用无水硫酸钠除去有机相中水分,过有机滤膜(孔径为0.22 μm)后将样品溶液装入瓶中于气相色谱仪中进行检测。根据标准品的出峰时间判定多糖中的单糖成分,以峰面积计算单糖的摩尔分数。

1.5 多糖的免疫活性研究

小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞于DMEM培养基(含10%小牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)中,37 ℃和5% CO2培养箱条件下培养。

采用MTT法测定白玉菇多糖对小鼠巨噬细胞RAW264.7的增殖活性的影响。用DMEM培养液将对数生长期细胞密度稀释至1.0×105个/mL,等量接种150 μL于96孔板中,孵育24 h。加入50 μL不同质量浓度的多糖溶液(终质量浓度为0、50、100、200、500 μg/mL),继续培养24 h后分别加入20 μL MTT试剂(5 mg/mL),继续培养4 h。吸除孔板中的液体,快速加入200 μL DMSO,室温振荡10 min,使用酶标仪在570 nm处测定吸光度。空白对照组为DMEM培养基,阳性对照组为脂多糖LPS。增值指数计算公式如下:

增值指数=A1/A0,

其中:A1为样品在570 nm处的吸光度;A0为空白对照在570 nm处的吸光度。

通过NO检测试剂盒测定白玉菇多糖对 LPS 诱导的RAW264.7细胞中NO产生的影响。按照上述方法培养48 h后,吸取100 μL培养液于新板中,加入Griess试剂,静置10 min;酶标仪540 nm处测定吸光度。空白对照组为DMEM培养基,阳性对照组为LPS。根据标准品NaNO2绘制的标准曲线计算NO释放量。

按照上述方法培养48 h后移除培养液,PBS清洗2次,加入100 μL中性红溶液,培养4 h后移除多余溶液;PBS清洗2次,加入细胞裂解液,室温放置1 h;酶标仪540 nm下测量吸光度。空白对照组为DMEM培养基,阳性对照组为LPS。

1.6 数据处理

实验至少重复3次,实验数据以(平均值 ± 标准差)形式表示。采用Origin 8.0软件绘制图表,利用SPSS 21.0软件进行数据统计学处理,使用t检验法进行数据比较。*表示P<0.05差异显著,**表示P<0.01差异极显著。

2 结果分析

2.1 白玉菇多糖的分离纯化

白玉菇子实体粉末经脱色脱脂后,常温提取液浓缩、脱蛋白、脱色、透析后得到多糖WHN。常温提取残渣经沸水浸提、离心、浓缩、脱蛋白、脱色、透析后得到多糖WHB。WHN和WHB分别通过DEAE-Cellulose 离子交换层析柱进行分离纯化,如图1所示。经0、0.1、0.2 mol/L NaCl溶液洗脱后共获得6个洗脱片段,浓缩、透析和冷冻干燥后,分别命名为WHN1、WHN2、WHN3、WHB1、WHB2、WHB3。

图1 DEAE-Cellulose离子交换层析柱洗脱曲线

2.2 白玉菇多糖化学组成分析

各组分的单糖组成及其成分分析结果见表1所列。从表1可以看出,WHN和WHB的总糖质量分数分别为67.72%、80.54%,蛋白质质量分数分别为28.65%、15.63%,糖醛酸质量分数分别为2.13%、0.41%。随着提取温度的增加,更有益于多糖的溶出。2种粗多糖经分离纯化后得到6种组分,总糖质量分数为93.48%～98.77%,同时蛋白质、糖醛酸得到有效洗脱,质量分数较小。

表1 白玉菇粗多糖和分级组分的理化性质分析 %

单糖组成分析结果显示2种粗多糖均为含有6种单糖的杂多糖。WHN中半乳糖的摩尔分数最大,达到49.8%。WHB的单糖组成以葡萄糖为主,摩尔分数为79.8%。组分间差异可能是由于WHN是在温和条件下提取到的胞外多糖,WHB为剧烈条件下提取到的不同部位多糖。常温水提多糖WHN的半乳糖随着DEAE-Cellulose 离子交换层析柱的洗脱逐渐减少,WHN1、WHN2、WHN3中半乳糖的摩尔分数分别为39.4%、35.6%、26.5%,同时各组分间葡萄糖的摩尔分数增加到34.3%、25.8%、25.4%。WHB的各分级组分的单糖组成以葡萄糖为主,摩尔分数分别为78.5%、90.8%、100.0%。结果显示WHB3为葡聚糖,WHB1和WHB2为含有葡萄糖和少量的甘露糖、半乳糖或阿拉伯糖的杂多糖。比较8种多糖组分发现,单糖组成差异可能与提取温度及纯化方法有关。

2.3 白玉菇多糖的免疫活性分析

多糖WHN及其3种分级组分对多巨噬细胞增殖活性的影响如图2a所示。从图2a可以看出:在实验质量浓度范围内,与空白对照组相比,WHN及其3种分级组分对RAW264.7细胞均无毒性,表现为促进细胞增殖且增殖指数随多糖质量浓度的增大呈剂量依赖性减小;WHN1、WHN2、WHN3在实验质量浓度范围内极显著地提高了细胞增殖指数(P<0.01),20 μg/mL处理时增殖指数最大,分别达到1.48、1.25、1.27,3种分离组分对细胞增殖活性的促进作用均高于WHN,其中WHN1最优。

图2 白玉菇多糖对巨噬细胞增殖活性的影响

WHB及其3种分级组分对巨噬细胞增殖活性的影响如图2b所示。从图2b可以看出,在实验质量浓度范围内,与空白对照组相比,4种组分对RAW264.7无细胞毒性,均显著促进细胞增殖(P<0.01)。其中,WHB在质量浓度为100 μg/mL时增殖指数达到最大值1.50。WHB1处理的细胞增殖活性随着多糖质量浓度的增大呈剂量依赖性减小,20 μg/mL处理时增殖指数最大为1.32。50 μg/mL WHB2和WHB3处理时细胞增殖指数最大,分别为1.37和1.53,其中WHB3在实验质量浓度范围内表现出最佳的增殖活性。比较8种多糖片段,多糖对细胞增殖活性的影响可能与葡萄糖的摩尔分数有关。

研究表明,巨噬细胞的吞噬作用在免疫反应中起重要作用,是免疫反应中的第1个关键步骤[16]。8种多糖组分对RAW264.7细胞吞噬作用的影响如图3所示。从图3a可以看出,WHN及其分级组分均在不同程度上刺激提升了巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力。在多糖质量浓度为20～50 μg/mL,与空白对照相比,WHN和WHN3极显著地促进细胞吞噬作用(P<0.01)。在实验质量浓度范围内,WHN1促进巨噬细胞RAW264.7吞噬的活性随着质量浓度的增加而减小,20 μg/mL时,吞噬能力最佳,与空白对照组相比,差异极显著(P<0.01)。结果表明,WHN1在各质量浓度下促进巨噬细胞RAW264.7吞噬作用的活性优于其他2种组分。

图3 白玉菇多糖对巨噬细胞吞噬活性的影响

从图3b可以看出,随着多糖WHB质量浓度的增加,细胞吞噬作用增强,在质量浓度为200 μg/mL时,巨噬细胞RAW264.7的吞噬活性显著提高(P<0.01),质量浓度超过200 μg/mL后,吞噬活性随之减小。WHB1对吞噬作用的促进作用随着多糖质量浓度的增加先增大后减小,在50 μg/mL时,吞噬活性达到最大,差异极显著(P<0.01);WHB2对巨噬细胞RAW264.7吞噬能力的促进作用与WHB有相似的趋势,在多糖质量浓度为200 μg/mL时,细胞吞噬能力最佳,与空白对照组相比,显示出极显著差异(P<0.01)。WHB3对RAW264.7细胞吞噬能力的作用随着多糖质量浓度的增加显示出剂量依赖性减弱,20 μg/mL时,吞噬活性达到最大2.40,与空白对照组相比差异极显著(P<0.01)。在实验范围的各质量浓度下,WHB3的吞噬活性优于其他组分。

NO是巨噬细胞攻击异物时释放的主要活性氧(reactive oxide species,ROS)之一[17]。8种组分对巨噬细胞NO释放量的影响如图4所示。从图4a可以看出,在实验质量浓度范围内,实验组与空白对照组相比均表现为促进NO产生。其中水提组分WHN、WHN2、WHN3对NO释放量的影响随着多糖质量浓度的增大呈剂量依赖性增大,质量浓度为500 μg/mL时NO释放量达到最大值,分别为2.89、4.12、2.16 μmol/L。WHN1刺激RAW264.7细胞释放的NO释放量呈先增大后降低的趋势,在200 μg/mL时达到最大值4.64 μmol/L,促进NO产生效果优于其他组分。

图4 白玉菇多糖对巨噬细胞NO释放量的影响

热水提组分WHB、WHB1、WHB2刺激RAW264.7细胞NO释放的效果与多糖质量浓度成正比。在各实验质量浓度下,WHB3刺激RAW264.7细胞释放NO与空白对照组相比均差异极显著(P<0.01),与多糖WHB1和WHB2相比,WHN3显示出最佳的刺激活性,在500 μg/mL时达到最大值4.11 μmol/L。

3 结 论

本文对白玉菇常温水提多糖WHN和沸水浸提多糖WHB分离纯化出6种分级组分WHN1、WHN2、WHN3、WHB1、WHB2、WHB3,并对这8种组分进行理化性质和免疫活性的筛选。6种分级组分总糖质量分数为93.48%～98.77%,高于粗多糖,且蛋白质和糖醛酸的质量分数明显降低。受提取温度影响,单糖组成结果显示8种组分的单糖摩尔分数均不相同,其中WHN及其分级组分是以半乳糖和葡萄糖为主的杂多糖,WHB、WHB1、WHB2是以葡萄糖为主的杂多糖,WHB3为葡聚糖。体外免疫实验中,各组分对RAW264.7均无细胞毒性,表现为促进细胞增殖和吞噬,其中WHN1和WHB3处理的巨噬细胞表现出优异的免疫调节活性。WHN1在200 μg/L时NO释放量为4.64 μmol/L,500 μg/L WHN3处理时NO释放量为4.11 μmol/L,较好的免疫活性可能与高摩尔分数的葡萄糖有关。

研究结果从理化性质和免疫活性2个方面筛选出2种活性较好的白玉菇多糖,为其在药物和功能性食品的应用提供理论基础。文献[1]指出,具有1,3-β-Glc和1,6-β-Glc连接方式的香菇多糖和平菇多糖,通过促进细胞吞噬及上调NO释放来发挥较好的免疫调节活性,白玉菇多糖结构对免疫发生机制与信号通路调控的关系有待进一步研究。