基于分子生物信息学分析DYNC1H1 在肝癌中的表达及意义

韦 程，董明右，2，宗子傲，2，王俊利，2，范传滨，2

（右江民族医学院研究生学院1，医学检验学院2，广西 百色 533000）

肝癌（liver cancer）是消化系统恶性程度极高的肿瘤之一，易复发、易转移，进展期死亡率极高[1]，目前缺乏有效的早期肝癌诊断标志物和方法。随着高通量技术，如测序技术和转录组学探索理论和技术的飞速发展，其在肿瘤损伤机体机制的分析中起着非常重要的作用。动力蛋白在动物体内的主要功能是细胞质动力蛋白（cytoplasmic dynein 1，Dynein）和轴突动力蛋白[2]。Dynein 负责逆行导向转运细胞微管，并在细胞进行有丝分裂时发挥作用，轴突动力蛋白主要分布于鞭毛和纤毛的组装。Dynein 由若干条轻链和6条不同分型的二聚体链构成，6 条二聚体链分别是2 条DYNC1H1（Cytoplasmic Dynein 1 Heavy Chain 1）、DYNC1I1、DYNC1I2、DYNC1LI1、DYNC1LI2[3]。Dynein 调节细胞有丝分裂并与一些癌症的相关过程联动进而加速肿瘤的形成，如果Dynein 的功能受到破坏，有丝分裂过程可能会变得异常，这个过程反而会抑制肿瘤的产生和发展。已经研究证实DYNC1H1 可作为潜在的生物标志物辅助诊断结直肠癌[4]，在胰腺癌中也发现了DYNC1H1 的突变[5]。除重链之外，已经有研究表明Dynein 的轻链表达滴度跟几种常见的人类癌症有关。Dynein 已经成为有效的抗癌药物靶点标记，并研究出使Dynein失去活性，进一步降低介导平滑肌运动的Hedgehog途径[6]。因此，Dynein 不仅在癌症病理机制上提供见解，还在临床药物治疗方案上展现可观的潜能。DYNC1H1 突变通常会引起一些伴常染色体呈显性遗传的影响智力发育表现的疾病，但在肝癌中DYNC1H1 的表达和基因改变情况、临床意义并不明确。本研究主要运用线上生物信息分析平台，在TCGA 项目和GEO 数据库对DYNC1H1 进行了肝癌分析，主要包含肝癌患者的病理标本，癌旁组织以及正常肝脏对照样本数据，包括表达差异、表达水平与生存之间的相关性、基因改变、免疫浸润和相关的细胞通路，以求揭示DYNC1H1 表达水平与肝癌发生发展的关联，肝癌中DYNC1H1 基因变异的情况，以获得DYNC1H1 对肝癌预后的价值和其他潜在的功能。

1 材料与方法

1.1 基因和蛋白表达分析 TIMER2.0 数据库是能系统评估各种癌症类型免疫浸润的综合数据库，提供多种方法评估免疫浸润程度，允许科研人员在线动态生成高质量的图形，以全面探索多种肿瘤的免疫组学、临床表现和基因组学特征，见图1，进入在线TIMER2.0 数据库（http://timer.cis-trome.org/），选择评估方法、关注的肿瘤类型、目标基因即可算出免疫细胞的浸润数据，并提供一键在线可视化[7]。利用该平台分析肝细胞癌和其他类型癌组织中DYNC1H1的表达水平并分析其差异，探索DYNC1H1 水平是否与肝癌患者预后相关联。设置的参数默认使用在线平台的初始状态。从GEPIA（gene expression profiling interactive analysis，http://gepia2.cancer-pku.cn）[8]网站收集了9736 例肿瘤样本和8587 例健康样本，并将所有RNA 序列进行数据化的信息统计归纳类，其中的基因数据全部来自癌症基因组图谱库（the cancer genome atlas，TCGA）[9]和基因型组织表达数据集（the genotype tissue expression，GTEx）[10]，分析DYNC1H1 mRNA 的水平。设置的参数默认使用在线平台的初始状态。UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu）TCGA RNA-seq 和31 种癌症类型的临床数据，用于TCGA 基因表达数据的深入分析[11]。使用临床蛋白质组学肿瘤分析联盟（CPTAC，http://ualcan.path.uab.edu/analysis-prot.html）分析DYNC1H1 在肿瘤和正常样本中的相对表达，以及基于个体肿瘤分级的各种肿瘤模型中的相对表达。

图1 肝癌中DYNC1H1 mRNA 的表达水平

1.2 生存预后分析 使用GEPIA2.0 网络工具进行患者生存分析。将DYNC1H1 基因输入“生存分析”模块，选择一个自定义的癌症类型，并使用Log-rank检验进行总体生存分析。高表达和低表达队列被高（50%）和低（50%）截断值划分。Kaplan-Meier 绘图仪（http://kmplot.com/analysis/）能够评估54 000 个基因（mRNA、miRNA 和蛋白质）对21 种癌症类型生存的影响。数据库的来源包括GEO、EGA 和TCGA[12]。在“肝癌RNA-seq”模块中分析了DYNC1H1 在不同癌症类型中的表达与生存之间的相关性。

1.3 遗传改变分析 cBioportal 数据库（http://www.cbioportal.org）[13]提供分析研究肿瘤相关基因进行数据化和可视化工具。采用该平台分析肝癌组织中DYNC1H1 基因改变情况（是否有基因突变、扩增等）及其与患者预后的关系。在“查询”部分选择了“精心策划的非冗余研究集”（184 项研究，48 035 个样本），并输入“DYNC1H1”进行DYNC1H1 的遗传改变特征查询。然后，将DYNC1H1 mRNA 表达水平与对照组进行比较。在“图”模块中获得假定的拷贝数改变（mRNA VS CNA），DYNC1H1 的突变位点信息可以显示在“突变”模块中。使用“比较/生存”模块来获得有或没有DYNC1H1 基因改变的癌症病例的总体和无复发生存差异的数据。

1.4 免疫滤过分析 使用TIMER2.0 系统分析不同癌症类型的免疫浸润的资源。将PPP1R14B 基因输入“免疫”部分的“基因”模块，然后选择免疫浸润类型，获得不同癌症类型中其表达与免疫浸润水平的相关性数据。分析重要的免疫浸润细胞，包括T cell CD8+、Common lymphoid progenitor、NK cell activat ed、Cancer associated fibroblast、T cell CD4+、Macrophage M2。

1.5 PPP1R14B 相关基因富集分析 String（cn.stringdb.org）构建蛋白之间相互作用网络图（protein-protein interaction，PPI）。使用生物信息学方法显示蛋白物理相互作用、共表达、共定位、基因富集分析和网站预测等一系列相互作用的蛋白[14]。在“蛋白质名称”的查询中搜索了DYNC1H1，并选择了“人”。设置以下主要参数：网络边缘的含义（“证据”）、主动交互源（“文本挖掘”“实验”“数据库”“共同表达”“邻域”“基因融合”和“共发生”）、网络类型（“全网络”）、最低要求交互得分“中等置信度（0.400）”和显示的最大交互者数（“不超过10 个交互者”）。使用TIMER2.0 探索DYNC1H1 与不同癌症类型中DYNC1H1 结合的10 个相互作用因子的基因列表之间的相关性。在“探索”模块的“基因_corr”部分输入DYNC1H1 基因，然后输入9 个相互作用子的基因列表，以获得其表达的相关性数据。

1.6 统计学方法 DYNC1H1 拷贝数改变与其mRNA表达的关联的数据来自cBioPortal 网站（https://www.cbioportal.org/），然后使用GraphPadPrism（81 版）对视窗进行非配对t检验进行分析。P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 DYNC1H1 在肝癌中的表达 与癌旁正常组织进行比较DYNC1H1 在肝癌中呈高表达，见图1A。选择GTEx 数据集的正常组织作为对照，评估DYNC1H1 在肝癌和正常肝组织的表达差异，见图1B，与正常组织相比，DYNC1H1 在上述肿瘤组织中高表达。蛋白质表达水平的变化与疾病、药物作用或毒素作用直接相关。进一步分析了DYNC1H1 蛋白在肿瘤组织和正常组织中的表达差异，结果显示，与正常组织相比，DYNC1H1 蛋白在肝癌中高表达，见图1C。

2.2 DYNC1H1 在不同阶段肝癌中的高表达DYNC1H1 在肝癌早期表达水平显著升高，但在晚期和早期阶段之间无显著性差异。表明有可能涉及DYNC1H1 表达在癌症的起始阶段，而不是在癌症的进展阶段，见图2。

图2 肝癌中DYNC1H1 的过表达

2.3 DYNC1H1 评估肝癌预后的价值 以DYNC1H1基因表达的中位数为标准，将患者分为DYNC1H1基因高表达组（n=182）和低表达组（n=182）。DYNC1H1 基因低表达组的生存时间高于高表达组（P＜0.05），见图3A；高表达的DYNC1H1 与肝癌的总生存期（OS）的不良预后相关，见图3B。上述数据均显示，DYNC1H1 的高表达与肝癌的不良预后密切相关，这可能是一种很有前途的肝癌预后标志物。

图3 TCGA 中DYNC1H1 基因表达与肝癌生存预后的相关性

2.4 DYNC1H1 基因的突变特征 CNA 的“突变”型是肝癌的主要改变类型，改变频率为3%，见图4A。从TCGA 泛癌数据集发现DYNC1H1 被扩增，且mRNA 表达量显著较高，见图4B。DYNC1H1 基因改变的类型、位点和病例数见图4C。DYNC1H1 的错义突变是主要的基因改变类型，并在10 例病例中检测到。DYNC1H1 基因改变与肝癌的临床生存之间的关系见图4D，DYNC1H1 改变的病例表现出较差的OS（Logrank TestP-value=0.166）。结果提示，肝癌中DYNC1H1 的基因改变参与了DYNC1H1mRNA 表达的改变且临床生存率较差，值得更深入的研究。

图4 肝癌中DYNC1H1 的突变特征

2.5 DYNC1H1 基因表达与免疫浸润的相关性分析 在肝癌中，DYNC1H1 的表达与免疫细胞（T cell CD8+、Common lymphoid progenitor、NK cell activated、Cancer associated fibroblast、T cell CD4+、Macrophage M2）浸润水平呈正相关（0＜P＜0.05），见图5A～图5F。

图5 肝癌中DYNC1H1 的表达与免疫细胞浸润的相关性

2.6 DYNC1H1 相关基因富集分析 String 分析共筛选出5 个已证实或预测的与DYNC1H1 相互作用蛋白，包括DCTN1，DYNC1I2，DYNC1LI2，DYNC1LI1，PAFAH1B1，见图6A。在肝癌中，DYNC1I2、PAFAH1B1、DCTN1 的表达与DYNC1H1 呈正相关，见图6B～图6F。结合GEPIA2 工具和TCGA 的所有肿瘤表达数据，获得了与DYNC1H1 的表达相关的前100 个基因，对上述两组的交叉分析得到了1 个共同的成员，即DCTN1，见图6G。DCTN1 与DYNC1H1 的表达呈较强的正相关，见图6H。KEGG通路分析数据进一步表明，DYNC1H1 可能通过“抗利尿激素调节水的再吸收”“沙门氏菌感染”“噬菌体”“亨廷顿病”“帕金森病”“肌萎缩性侧索硬化症”“神经退行性便”“朊病毒疾病”参与肝癌的发生，见图6I。生物过程富集分析表明，这些基因主要与核包膜拆卸、核迁移、逆行轴突运输、中心体定位、主轴建立、有丝分裂纺锤体方向的建立的生物过程有关，见图6J。

图6 DYNC1H1 相关基因富集分析

3 讨论

本研究发现DYNC1H1 在肝癌存在高表达，并且在早期阶段存在显著差异，这表明DYNC1H1 可能参与了肝癌的起始过程。此外，DYNC1H1 水平较高的患者预测肝癌的临床预后较差。DYNC1H1 在肝癌中的突变特征分析显示，以“突变”为主要类型的肝癌患者中DYNC1H1 的改变频率最高（3%），而肝癌中DYNC1H1 的基因改变，改变了其mRNA 的表达。与未改变的DYNC1H1 组相比，DYNC1H1 改变的肝癌病例表现出较差的临床生存期。

免疫细胞的浸润是大多数恶性肿瘤的标志。免疫浸润水平与癌症的发生、进展或转移密切相关。Dynein 在T 细胞的生长发育和活化中发挥作用。当T 细胞识别抗原提呈细胞上的复合体时，产生T 细胞受体簇（T cell receptor microclusters，TCR-MC）并且在Dynein 的驱动下形成中央超分子活化簇（Central supramolecular activation，CSMAC）。TCR-MC 运动所形成的CSMAC 依赖于dynein 和微管（Microtubules，MTs），该运动调节着T细胞活化[15]。Kreutzer M 等[16]报道，在多发性硬化症（Multiple sclerosis）模型中，由DYNC1H1 介导的轴突运输的缺陷与轴索病变有关，其免疫组化结果显示DYNC1H1 在翻译水平上出现下调，提示DYNC1H1可能是反映MS 病变的反应蛋白之一。在肝癌中，DYNC1H1 的表达与免疫细胞（T cell CD8+、Common lymphoid progenitor、NK cell activated、Cancer associated fibroblast、T cell CD4+、Macrophage M2）浸润水平呈正相关。

此外，为了揭示DYNC1H1 在肝癌进展中的作用机制，本研究确定了与DYNC1H1 蛋白网络相关的共表达基因，结果表明，在大多数癌症中，DCTN1与DYNC1H1 的表达呈较强的正相关关系。目前有多种动力蛋白与癌症发生发展有关，边毅等[17]研究阐述了皮肤恶性黑色素瘤的发生与动力蛋白激酶2以及CD16 表达成正比。张琳等[18]的研究结果表明在肺腺癌中轴丝动力蛋白中链基因1 低表达并且抑制肺腺癌细胞侵袭能力。研究发现[18，19]，Tctex-1 高表达于肾癌组织，并且帮助确诊，是肾癌临床分期、病理分级的指标，可能对肾癌术后辅助治疗有一定的参考价值。翟丽娜等[20]研究发现，线粒体动力蛋白MiD49 在肝癌中表达显著上调，肝癌细胞的增殖会受到MiD49 的调控，且抑制凋亡，说明MiD49 是内在的促癌因子并可作为潜在的肿瘤治疗靶标。由此可以推断，动力蛋白与肿瘤的生长、癌细胞的转移侵袭有关。

尽管跨多个数据库整合了关于DYNC1H1 在肝癌症中的作用信息，但仍有局限性。由于DYNC1H1的微阵列和测序数据是通过分析肿瘤组织信息收集的，因此免疫细胞标记物分析可能会引入系统偏倚。同时也没有关于DYNC1H1 翻译后修饰的信息，这可能会影响其功能。此外，本研究仅对不同数据库中DYNC1H1 在肝癌中的作用进行了生物信息学分析，还需要进行体内和体外实验验证和进一步的机制研究。癌症的进化包括遗传、细胞状态、表观遗传、空间和微环境因素的复杂相互作用。随着测序和组学技术的快速发展，多组学、单细胞多组学和空间转录组学将为肿瘤复杂环境的研究增添动力。

综上所述，DYNC1H1 可影响肝癌的预后，并与免疫浸润密切相关。DYNC1H1 表达增加与肝癌的不良预后和免疫浸润水平增加相关。DYNC1H1 可作为肝癌的预后生物标志物。这些发现可能提供了一种针对DYNC1H1 的抗肿瘤策略，包括操纵肿瘤细胞的生长或免疫细胞的浸润。