唑吡坦对低压低氧致失眠模型小鼠的镇静催眠作用

梁欢欢，许琳，俞纲，苏瑞斌，李明媛

（1.天津科技大学生物工程学院，天津市透明质酸应用研究企业重点实验室，天津 300457；2.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850）

高原地区海拔高、空气密度低，致使机体产生应激反应，其中高原睡眠障碍作为最常见的不适反应之一而备受关注［1］。睡眠障碍可使机体功能紊乱，引发食欲不振、精神萎靡、免疫力下降等不良反应，长期睡眠障碍可造成不可逆的脑功能损害，甚至诱发心脑血管疾病、抑郁等严重疾病［2］。通过药物治疗有效缓解高原睡眠障碍、提高睡眠质量已经成为高原条件下保障正常生活工作的迫切需要。目前临床用于治疗高原睡眠障碍的首选药物为经典镇静催眠药苯二氮类及非苯二氮类药物［3］。非苯二氮类药物如唑吡坦和右佐匹克隆等具有半衰期短、不易产生耐受和依赖的优点［4］。

脑内存在多个睡眠-觉醒调节系统，通过不同脑区的神经元投射和突触传递共同参与睡眠-觉醒状态的调节［5］。促觉醒系统通过中脑的旁正中区域进入丘脑形成的背侧通路，使丘脑能够处理与感觉、运动反应和认知相关的信号。研究表明，丘脑损伤患者和动物往往难以保持清醒，睡眠时间过长［6］。而睡眠状态是由丘脑网状核中抑制性γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能神经元、丘脑皮质中继神经元和皮质锥体神经元之间相互作用产生的结果，其中丘脑皮质中继神经元通过去极化/超极化的方式产生紧张性/抑制性活动，提供状态依赖的感觉信息门控，从而调节清醒和睡眠状态［7］。下丘脑视交叉上核在昼夜间分别通过GABA 能或谷氨酸（glutamic acid，Glu）能神经元节律性控制松果体褪黑激素分泌，快动眼睡眠期间视交叉上核神经元活动增加，非快动眼睡眠期间减少［8］。下丘脑腹外侧视前区以释放GABA 和甘丙肽的方式向促觉醒区域传递抑制性信号，促进睡眠发生；当其受损时，机体睡眠结构发生改变且睡眠时间减少［9-10］。此外，下丘脑外侧神经元中促食欲素神经元为促觉醒的关键细胞类型，其特异性丢失会产生嗜睡症［11］。综上所述，丘脑和下丘脑及Glu 能和GABA 能传递在睡眠-觉醒状态调节中至关重要。

本研究采用低压低氧动物实验舱建立小鼠高原睡眠障碍模型，以评价唑吡坦对高原睡眠障碍的治疗作用，并通过检测神经递质Glu 和GABA 的含量探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性C57BL/6J小鼠，SPF级，6～8周，体重18～20 g，购于北京斯贝福生物科技有限公司，实验动物生产许可证号SCXK（京）2019-0010。饲养环境温度24 ℃，湿度55%～65%，12 h 昼夜更替（光照时间8∶00～20∶00），小鼠可自由摄食饮水。

1.2 药品、试剂和仪器

戊巴比妥钠（批号020919），北京化学试剂公司；唑吡坦（纯度97.2%，批号171258-201602），中国食品药品检定研究院；标准品Glu 和GABA（色谱纯），美国Sigma 公司；无水甲醇（色谱纯），德国赛默飞公司；超纯水，广州屈臣氏食品饮料有限公司；其余试剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

FLYDWC50-11C 低压低氧实验动物舱，贵州风雷航空军械有限责任公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，巩义市英峪仪器厂；安捷伦1260 型色谱仪，美国安捷伦公司；TissuelyserⅡ高通量组织研磨仪，德国Qiagen 公司；Centrifuge 5424R 高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；TP 300 超声波清洗机，北京天鹏电子新技术有限公司。

1.3 常压常氧条件下翻正反射消失（loss of righting reflex，LORR）实验及戊巴比妥钠致小鼠镇静催眠阈下和阈上剂量的确定

在相对安静的实验环境下，小鼠ip 给予戊巴比妥钠20，25，30，35，40，45 和50 mg·kg-1后以仰卧位轻轻置于笼中，每隔1 min 翻转小鼠1 次，若其保持仰卧位时间≥1 min，则判定为LORR；若小鼠在1 min 内恢复至俯卧位的次数≥2 次，则判定为翻正反射恢复［12］。观察小鼠LORR 率、首次出现LORR的潜伏期和LORR 持续时间。将LORR 率介于0%～10%和100%的剂量分别确定为戊巴比妥钠镇静催眠阈下和阈上剂量［13］。其中，LORR率（%）=出现LORR动物数/动物例数×100%。

1.4 小鼠低压低氧致失眠模型的建立

小鼠适应性饲养后，按体重随机分为常压常氧对照组和低压低氧处理1，2 或5 d 组，每组10 只。常压常氧对照组小鼠在常压常氧环境（海拔55 m，大气压101.3 kPa、氧分压21.1 kPa）中饲养1 d，低压低氧处理组置于低压低氧实验动物舱内分别处理1，2 或5 d，处理开始时在10 min 内将舱内大气压力和氧分压匀速降至51.7 和0 kPa，以模拟海拔5500 m 高原环境。舱内温度控制在（23±2）℃，小鼠可自由摄食、饮水。处理结束时将舱内大气压力和氧分压在3 min 内上升至101.3 和21.1 kPa，将低压低氧处理组小鼠从氧舱内取出后ip 给予阈上剂量戊巴比妥钠并观察其LORR 情况。以LORR潜伏期显著延长、LORR 持续时间显著缩短作为低压低氧致失眠模型造模成功的判断标准。

1.5 唑吡坦与戊巴比妥钠镇静催眠协同实验

小鼠按体重均衡分为常压常氧溶媒组、常压常氧唑吡坦组、低压低氧致失眠模型组和低压低氧致失眠模型+唑吡坦组，每组8只。各组小鼠经常压常氧或低压低氧处理1 d 后，常压常氧溶媒组和低压低氧致失眠模型组ip 给予溶媒（含4% DMSO 和2% 吐温-80 的水溶液），常压常氧唑吡坦组和低压低氧致失眠模型+唑吡坦组ip 给予唑吡坦0.33，1，3，9 和27 mg·kg-1，20 min 后各组小鼠ip 给予阈下剂量（20 mg·kg-1）或阈上剂量（50 mg·kg-1）戊巴比妥钠，记录小鼠LORR潜伏期和LORR持续时间。

1.6 唑吡坦致小鼠翻正反射消失实验

小鼠分为常压常氧唑吡坦组和低压低氧唑吡坦组，分别在常压常氧或低压低氧环境处理1 d，而后各组分别ip 给予唑吡坦10，13，17，20，23，30 和40 mg·kg-1，观察各组小鼠LORR率。

1.7 高效液相荧光法测定小鼠丘脑和下丘脑中神经递质Glu和GABA含量

1.7.1 色谱条件［14］

新时期公路桥梁检测质量控制与检测技术应用实践分析……………………………………………………… 曾邵梅（8-100）

安捷伦C18 反相色谱柱（4.6 mm×150 mm，4 μm）。流动相A：含磷酸氢二钠0.04 mol·L-1，乙二胺四乙酸二钠0.1 mol·L-1和0.2%三乙胺的水溶液，用磷酸调节pH 至6.3；流动相B：将50%甲醇、10%四氢呋喃和40%流动相A 混匀，用磷酸调节pH 至6.3，0.45 μm 微孔滤膜抽滤脱气，超声40 min备用。设定激发波长340 nm，发射波长450 nm；柱温：18 ℃。梯度洗脱条件：0～8 min，100%流动相A，流速0.8 mL·min-1；8～17 min，45%流动相A+55%流动相B，流速0.8 mL·min-1；17～25 min，25%流动相A+75%流动相B，流速1.0 mL·min-1；25～33 min，70%流动相A+30%流动相B，流速1.0 mL·min-1。

1.7.2 标准曲线绘制

用人工脑脊液配制Glu 和GABA 标准品溶液，浓度梯度为0.195，0.39，0.78，1.5625，3.125 和6.25 μmol·L-1。取20 μL 不同浓度标准溶液，加入10 μL 邻苯二甲醛衍生化试剂（邻苯二甲醛2.5 mg溶于0.5 mL 无水甲醇中，加入0.5 mL 0.1 mol·L-1的四硼酸钠溶液，再加入4 μL β-巯基乙醇，混匀后4 ℃避光保存），混匀后避光反应1.5 min，取20 μL进样，检测Glu和GABA含量。以标准品浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标进行线性回归分析得到Glu和GABA标准曲线。

1.7.3 实验分组处理及Glu和GABA含量测定

小鼠分为常压常氧溶媒组、常压常氧唑吡坦组、低压低氧致失眠模型组和低压低氧致失眠模型+唑吡坦组，各组小鼠在常压常氧或低压低氧环境中处理1 d 后，常压常氧溶媒组和低压低氧致失眠模型组ip 给予溶媒，常压常氧唑吡坦组和低压低氧致失眠模型+唑吡坦组ip 给予唑吡坦10，20 和40 mg·kg-1，给药后常压常氧溶媒组和常压常氧唑吡坦组置于常压常氧环境，低压低氧致失眠模型组和低压低氧致失眠模型+唑吡坦组放入低压低氧环境中，1 h后迅速处死并取脑，于冰上快速剥离出丘脑和下丘脑放入液氮，称重后转移至EP管中，加入2颗直径4 mm 钢珠，按10 mL·g-1加入超纯水，匀浆2 min。4 ℃，15 984×g离心10 min，将上清液转移至新EP 管中。衍生化反应后，取20 μL 进样，检测Glu和GABA含量。

由标准曲线求得样品中Glu 和GABA 浓度（μmol·L-1）。脑组织神经递质含量（ng·g-1丘脑或下丘脑湿重）=样品神经递质浓度（μmol·L-1）×进样体积（μL）/样品重量（g）。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 常压常氧环境下不同剂量戊巴比妥钠对小鼠LORR的影响

实验结果显示，ip给予戊巴比妥钠20，25,30,35,40,45 和50 mg·kg-1时，小鼠LORR 率分别为0%，20%，60%，90%，90%，100%和100%，其中戊巴比妥钠50 mg·kg-1诱导效应最稳定且重现性好，故确定50 mg·kg-1为戊巴比妥钠镇静催眠阈上剂量。以20 mg·kg-1为戊巴比妥钠镇静催眠阈下剂量。

2.2 低压低氧环境对戊巴比妥钠镇静催眠阈上剂量诱导小鼠LORR效应的影响

与常压常氧对照组相比，低压低氧处理1，2 或5 d使小鼠LORR潜伏期显著缩短（P＜0.01，图1A），低压低氧处理1 或2 d 小鼠LORR 持续时间显著缩短（P＜0.05，P＜0.01，图1B）。

2.3 常压常氧或低压低氧环境对唑吡坦协同戊巴比妥钠致小鼠镇静催眠效应的影响

常压常氧唑吡坦0.33，1，3，9 和27 mg·kg-1组小鼠协同阈下剂量戊巴比妥钠诱导LORR 率分别为0%，0%，50%，87.5%和100%，ED50为2.94 mg·kg-1（图2A），提示唑吡坦可协同阈下剂量戊巴比妥钠发挥镇静催眠作用。与常压常氧溶媒组比较，常压常氧唑吡坦3，9 和27 mg·kg-1组LORR 潜伏期显著缩短（P＜0.01，图2B），9 和27 mg·kg-1组LORR 持续时间显著延长（P＜0.01，2C）。

在阈上剂量戊巴比妥钠协同实验中，与常压常氧溶媒组相比，常压常氧唑吡坦9 和27 mg·kg-1组LORR 潜伏期显著缩短（P＜0.01，图2D），3，9 和27 mg·kg-1组LORR 持续时间显著延长（P＜0.05，P＜0.01，图2E）。

Fig.2 Effect of zolpidem on LORR induced by zolpidem synergy subthreshold（A，B and C）and upper-threshold（D and E）pentobarbital sodium in normoxic environment.Mice in normoxia vehicle group and normoxia zolpidem groups were treated in a normoxia environment for 1 d，and were ip given vehicle or zolpidem（0.33，1，3，9 and 27 mg·kg-1）20 min before being ip treated with 20 mg·kg-1（subthreshold）or 50 mg·kg-1（upper-threshold）pentobarbital sodium，then LORR was observed.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normoxia vehicle（Veh）group.

低压低氧致失眠模型+唑吡坦0.33，1，3，9 和27 mg·kg-1组协同阈下剂量戊巴比妥钠引起LORR率分别为0%，0%，0%，87.5%和100%（图3A），ED50为9.22 mg·kg-1。与低压低氧致失眠溶媒组相比，低压低氧致失眠模型+唑吡坦9 和27 mg·kg-1组LORR 潜伏期显著缩短（P＜0.01，图3B），LORR持续时间显著延长（P＜0.05，P＜0.01，图3C）。

Fig.3 Effect of zolpidem on LORR induced by zolpidem synergy subthreshold（A，B and C）and upper-threshold（D and E）pentobarbital sodium in hypoxic environment.Mice in hypoxia induced insomnia vehicle group and hypoxia induced insomnia zolpidem groups were treated in a hypoxic environment for 1 d，and were ip given vehicle or zolpidem（0.33，1，3，9，27 mg·kg-1）20 min before being ip treated with pentobarbital sodium 20 mg·kg-1（subthreshold）or 50 mg·kg-1（upper-threshold），then LORR was observed.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with hypoxia induced insomnia Veh group.

在阈上剂量戊巴比妥钠协同实验中，低压低氧致失眠模型+唑吡坦9 和27 mg·kg-1组较低压低氧致失眠模型组LORR 潜伏期显著缩短（P＜0.05，P＜0.01，图3D），LORR持续时间显著延长（P＜0.05，P＜0.01，图3E）。

2.4 常压常氧或低压低氧环境下唑吡坦对小鼠LORR的影响

在常压常氧和低压低氧环境下，唑吡坦诱导LORR 的ED50分别为16.21 和20.55 mg·kg-1（图4）。提示在低压低氧环境下，唑吡坦的镇静催眠作用减弱。

Fig.4 Effect of zolpidem on LORR of mice in normoxic and hypoxic environments.Mice were treated in a normoxic or hypoxic environment for 1 d，normoxia and hypoxia groups were ip given zolpidem 10，13，17，20，23，30 and 40 mg·kg-1，respectively.Then LORR was observed.n=10.

2.5 常压常氧或低压低氧环境下唑吡坦对小鼠丘脑和下丘脑Glu 和GABA 含量及Glu/GABA 比值的影响

与常压常氧溶媒组相比，常压常氧唑吡坦40 mg·kg-1组小鼠丘脑中Glu 含量显著降低（P＜0.01，图5A），各组GABA 含量及Glu/GABA 比值均无显著变化（图5A 和C）。与常压常氧溶媒组相比，常压常氧唑吡坦40 mg·kg-1组下丘脑中Glu含量显著降低（P＜0.05，图5B），GABA 含量各组间无显著差异（图5B），Glu/GABA 比值显著下降（P＜0.05，图5D）。

与常压常氧溶媒组相比，低压低氧致失眠模型组小鼠丘脑中Glu 和GABA 含量及Glu/GABA 比值均无显著变化（图6A 和C）；下丘脑中Glu 含量显著升高（P＜0.01，图6B），Glu/GABA 比值显著升高（P＜0.05，图6D）。与低压低氧致失眠模型组相比，低压低氧致失眠模型+唑吡坦组小鼠丘脑中Glu 和GABA 含量及Glu/GABA 比值均无显著变化（图6A和C）；下丘脑中低压低氧致失眠模型+唑吡坦40 mg·kg-1组Glu 含量显著降低（P＜0.05，图6B）；低压低氧致失眠模型+唑吡坦20 和40 mg·kg-1组Glu/GABA比值显著降低（P＜0.05，图6D）。

Fig.5 Effect of zolpidem on glutamic acid（Glu），γ-aminobutyric acid（GABA）and Glu/GABA in thalamus（A and C）and hypothalamus（B and D）of mice in normoxic environment.Mice were treated in a normoxic environment for 1 d，and then were ip given vehicle or zolpidem（10，20，40 mg·kg-1）1 h before sample collection.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with veh group.

Fig.6 Effect of zolpidem on Glu，GABA and Glu/GABA in thalamus（A and C）and hypothalamus（B and D）of mice in hypoxic environment.Mice in the normoxia veh group were treated in normoxic environment for 1 d，hypoxia model group and hypoxia+zolpidem groups were treated in a hypoxic environment for 1 d，normoxia veh and hypoxia model groups were ip given vehicle，and hypoxia+zolpidem groups were ip given zolpidem（10，20，40 mg·kg-1）1 h before sample collection.±s，n=8.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normoxia veh group；#P＜0.05，compared with hypoxia model group.

3 讨论

低氧是造成高原睡眠障碍最直接、最重要因素。研究发现，从平原进入高原后，高原睡眠障碍发生率为41.5%，其中急进高原睡眠障碍发生率为71%～93%，均显著高于平原睡眠障碍发生率［15-16］。目前，针对高原睡眠障碍采取的预防及治疗措施主要包括氧疗、预习服、重复经颅磁刺激等，但这些方法不适用于急进高原，药物疗法因其便利性和有效性仍是主流疗法［17］。

高原低氧引起的睡眠障碍受神经网络系统调控，是一个复杂的病理过程，很难用离体实验进行模拟，其发病机制研究及防治药物研发需要整体动物体内实验验证［12］。药典推荐可以采用戊巴比妥钠协同诱导大鼠、小鼠LORR 实验作为简便快捷的催眠药物筛选方法来评判药物镇静催眠效果［18］。开展高原睡眠障碍药物治疗研究需要依托于良好的能够复制出高原睡眠障碍的模型，本课题选取能够模拟低压低氧环境的动物实验舱开展高原睡眠障碍模型构建及唑吡坦的药效评价研究［19］。同时以经典阈上剂量戊巴比妥钠诱导LORR 效应作为睡眠评价模型［20］。与文献［21］报道一致，小鼠缺氧处理1～5 d 均出现一定程度的神经功能紊乱，其中第1～2 天失眠状况最为显著，具体表现为阈上剂量戊巴比妥钠诱导小鼠LORR 持续时间较常压常氧对照组显著缩短，综合上述实验结果，最终确定以小鼠LORR 持续时间（睡眠稳定性）作为主要观察目标，以低压低氧处理1 d 作为低氧诱导睡眠障碍模型，开展后续研究。

本研究发现，唑吡坦在常压常氧或低压低氧条件下均可增加阈下剂量戊巴比妥钠诱导的LORR率、缩短LORR 潜伏期和延长LORR 持续时间，且缩短阈上剂量戊巴比妥钠诱导的LORR 潜伏期，延长LORR 持续时间，说明唑吡坦对高原睡眠障碍具有一定治疗效果。但在低压低氧条件下，同等剂量唑吡坦与阈下及阈上剂量戊巴比妥钠协同诱导LORR 效应弱于常压常氧条件。与此类似，低压低氧条件下，相同剂量的唑吡坦对小鼠镇静催眠作用弱于常压常氧条件下，该结果可能与低压低氧环境降低机体肝脏药物代谢相关酶细胞色素P450 表达水平及活性相关［22］。唑吡坦进入人体后的代谢与细胞色素P450 密切相关，抑制该酶活性时，血液中唑吡坦水平升高［23］，所以理论上，要达到相同的催眠效应，低压低氧条件下唑吡坦使用剂量应低于常压常氧条件下所需剂量，然而本实验结果却与之相反，说明存在其他的机制介导了该结果的产生。前期Gao 等［24］研究发现，低氧降低GABAA受体亚基α1mRNA 表达水平，使唑吡坦与GABAA受体亲合力减弱，对中枢神经系统产生的抑制作用减小。推测低压低氧使得中枢系统内GABAA受体表达量减少，药物进入体内后与受体结合率降低，进而使得药物镇静催眠作用减弱。

GABA是哺乳动物中枢神经系统中主要的抑制性神经递质，增强GABA 能神经传递可延长睡眠时间。唑吡坦作为GABAA受体的正向变构调节剂可延长抑制性突触后电流的持续时间，从而引发神经网络抑制，产生镇静催眠效应［25］。常压常氧条件下，随唑吡坦剂量增加，丘脑和下丘脑中Glu含量逐渐降低，其中40 mg·kg-1组效应显著，唑吡坦各剂量组对GABA 含量无明显影响，但40 mg·kg-1组显著性降低下丘脑中Glu/GABA 比值。此外，与常压常氧溶媒组相比，低压低氧处理使小鼠下丘脑中Glu含量和Glu/GABA 比值显著升高。下丘脑中，与低压低氧致失眠模型组相比，低压低氧致失眠模型+唑吡坦40 mg·kg-1组小鼠Glu 含量显著降低，GABA 含量无显著性变化，低压低氧致失眠模型+唑吡坦20 和40 mg·kg-1组Glu/GABA 比值显著降低。以上结果表明，唑吡坦与GABAA受体结合后产生的中枢抑制效应与其调节Glu而非GABA 水平相关，而Glu/GABA 比值的变化主要取决于Glu 水平的变化量。此外，研究发现常压常氧环境条件下，唑吡坦40 mg·kg-1对丘脑和下丘脑Glu 含量均有显著性影响，而在低压低氧条件下，相同剂量唑吡坦仅引起下丘脑Glu 含量的显著变化，提示低压低氧条件下唑吡坦对中枢神经系统影响范围变小，这一结果可能与低压低氧条件下唑吡坦镇静催眠效应减弱的现象有关，提示唑吡坦在治疗高原睡眠障碍时需要合理调整剂量，以达到理想的治疗效果。