Munc 18-1相互作用蛋白3变化对严重肝纤维化患者肝癌发病率和死亡率的影响*

闫会君 齐双玉 贺红晶 崔琳琳 许丙辉

1.衡水市人民医院肝胆胰外科 (河北 衡水,053000) 2.衡水市第四人民医院 脑电图科

肝纤维化是一种慢性肝损伤,主要由乙型和丙型肝炎病毒慢性感染、过量饮酒、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、自身免疫性肝病和遗传性疾病引起,以肝弥漫性纤维化、弥漫性炎症、再生结节、假小叶等是其主要特征[1]。流行病学研究表明,肝纤维化是发生肝细胞癌(HCC)的最大危险因素,80%～90% HCC患者确诊时具有肝纤维化[2],对肝纤维化向HCC进展进行干预可有效降低HCC发生率[3],因此寻找与肝纤维化进展为HCC具有密切相关性的生物标志物是研究重点。Munc18-1相互作用蛋白3(Mint3)是广泛存在于全身各种组织中的一种参与膜蛋白信号传导与运输的多结构域蛋白,被称为缺氧诱导因子-1(HIF-1)的激活剂[4],其可通过激活癌细胞和巨噬细胞中的HIF-1,促进糖酵解产生ATP[5],且研究证实Mint3可在体外实验中通过细胞-细胞接触依赖的方式促进肿瘤细胞增殖和肿瘤生长[6]。但Mint3在肝纤维化向HCC的进展过程中的作用尚未见相关报道。因此本研究通过对肝纤维化患者进行穿刺活检定期监测其肝组织内Mint3表达,长期随访肝纤维化患者HCC发病率与死亡率,旨在为肝纤维化进展为肝癌找到新的阻断方法。

1 资料与方法

1.1 研究对象 以2018年1月至2019年1月因肝纤维化住院需行肝穿刺活检的230例患者为研究对象,男性149例,女性81例;年龄45～70岁,平均(46.72±11.30)岁。纤维化分期S0、S1、S2、S3、S4期分别有5、30、98、79、18例。对研究对象定期监测Mint3表达情况,以病理诊断或者两种增强影像学提示为肝癌,截至2022年12月以是否发生肝癌分为两组:发生肝癌组(82例)、未发生肝癌组(148例)。其中发生肝癌组根据患者是否死亡分为肝癌死亡组(47例)肝癌存活组(35例)。

1.2 纳入及排除标准 纳入标准:①符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015 年版)》[7]中肝纤维化诊断标准,包括慢性病毒性肝炎、自身免疫性肝病、酒精性肝病等所致的肝纤维化患者;②入院需进行肝穿刺确定病情进展的患者;③临床资料完整;④依从性较好;⑤无其他恶性肿瘤;⑥随访满3年。排除标准:①既往诊断为肝癌、肝衰竭或肝移植者;②合并血液系统疾病患者;③合并肝脏血管畸形患者;④合并精神疾病患者;⑤合并自身免疫疾病患者;⑥中途退出研究者及临床资料不全者。本研究获得医院伦理委员会批准(伦理批号:201802025),研究对象及家属签署知情同意书。

1.3 研究方法

1.3.1 随访方法 基线日期为患者入院诊断为肝纤维化的时间,随访3年,观察终点为确诊为肝癌或随访时间满3年及随访期间死亡,以患者随访结束前或死亡前最后一次血液检测为截至日期。每6～12个月抽取患者静脉监测Mint3水平,常规进行肝功能检查和甲胎蛋白(AFP)检查。HCC诊断主要依据为活检病理学检查,若组织学检查不具有诊断性,根据AFP>20 μg/L联合影像学特征进行诊断。

1.3.2 肝组织活检 检测患者血小板计数、凝血酶原活动度、凝血酶原时间、血小板计数等指标,确定患者符合肝穿刺活检适应证后,在超声定位下通过穿刺枪行肝脏组织穿刺术,取肝组织10 mm×1 mm,10%福尔马林固定后送病理检查,确定患者是否发生肝癌。

1.3.3 免疫组化检测组织内Mint3 肝组织常规脱水处理,石蜡包埋后切片,后进行Mint3免疫组化染色,PBS代替一抗染色作为阴性对照组。免疫组化通过Leica Bond Max自动免疫组化仪完成,多聚赖氨酸处理玻片,步骤如下:二甲苯进行切片脱石蜡处理,梯度乙醇进行脱水处理;0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲液修复Mint3,时长为20 min,后Water buffer进行3次洗涤;切片内加入30 g/L过氧化氢甲醇溶液,避光15 min后用PBS洗涤3次,每次时长为5 min;加入山羊血清工作液(在37℃条件下);添加一抗后孵育过夜,PBS冲洗3次,每次时长为10 min;后加入二抗,孵育30 min(在37℃条件下)。PBS冲洗3次,每次时长为5 min;辣根过氧化物酶标记的链亲和素滴加,孵育30 min(在37℃条件下),PBS冲洗3次,每次时长为5 min;显色处理后用蒸馏水冲洗停止染色;苏木精复染后树胶密封。每张切片随机选取10个视野,通过TPP彩色图像分析软件测定每一视野中Mint3含量,取10个视野平均值作为本切片阳性染色含量。面密度为彩色图像分析软件测定单位。

1.3.4 血清指标检测 清晨抽取患者空腹血标本5 ml外周静脉血,3 000 r/min离心处理,时长为10 min,取上清,冰箱保存待测,通过逆转录聚合酶链反应检测血清中Mint3水平。磁微粒化学发光法检测肝纤维化4项:透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原N端肽(PC Ⅲ)和Ⅳ型胶原(Ⅳ-C),通过化学发光仪Autolumo A2000 Plus(郑州安图生物工程股份有限公司)以及其配套试剂检测完成。化学发光法检测AFP,通过DXI800全自动免疫分析系统及其配套试剂完成。

1.4 观察指标 ①定期监测比较两组患者3年内血清Mint3表达水平;②比较发生肝癌组患者死亡与未死亡Mint3相关性;③比较两组患者肝纤维化4项、AFP等;④分析Mint3表达与肝功能、AFP相关性;⑤分析肝纤维化发生肝癌的影响因素;⑥ROC曲线评价Mint3对肝纤维化发生肝癌的预测价值;⑦Kaplan-Meier曲线比较不同Mint3表达水平肝癌患者生存情况。

2 结果

2.1 发生肝癌组与未发生肝癌组患者血清Mint3含量比较 随访期内两组患者血清Mint3含量比较见表1。将发生肝癌组根据是否死亡分为发生肝癌死亡亚组与肝癌存活亚组,各随访节点患者血清Mint3含量比较见表2。

表1 发生肝癌组与未发生肝癌组患者随访期内血清Mint3含量比较

表2 肝癌死亡组与肝癌存活组患者随访期内血清Mint3含量比较

2.2 免疫组化检测 对患者肝组织进行免疫组化结果显示,发生肝癌患者肝组织中Mint3表达显著高于未发生肝癌患者(P<0.05)。见图1。

图1 免疫组化检测结果(HE染色×200)

2.3 两组患者入院时肝纤维化4项与AFP比较 见表3。

表3 发生肝癌组与未发生肝癌组入院肝纤维化4项与AFP比较

2.4 入院时Mint3与是否发生肝癌、发生肝癌是否死亡以及临床指标相关性 见表4。

表4 Mint3与肝癌发生、肝癌死亡、肝纤维化4项、AFP相关性

2.5 肝纤维化发生肝癌多因素分析 以肝纤维化患者最终是否发生肝癌为因变量,以入院时Mint3以及表3中差异有统计学意义的变量为自变量进行多因素分析,结果显示Mint3、HA、LN、PC-Ⅲ、Ⅳ-C以及AFP是肝纤维化患者发生肝癌的危险因素(P<0.05)。见表5。

表5 肝纤维化发生肝癌多因素分析

2.6 Mint3预测肝纤维化发生肝癌ROC曲线 ROC曲线得出入院Mint3值预测肝纤维化发生肝癌的AUC值为0.828,95%CI=0.720～0.951,P<0.001,灵敏度为0.762,特异度为0.898;预测肝纤维化发生肝癌死亡的AUC值为0.750,95%CI=0.578～0.830,P<0.001,灵敏度为0.693,特异度为0.798。见图2,3。

图2 Mint3预测肝纤维化发生肝癌的ROC曲线

2.7 肝纤维化患者发生肝癌后生存曲线 每位患者监测5次Mint3值,取均值计算本研究总Mint3平均值,以≤平均值为低水平,>平均值为高水平,肝纤维化患者发生肝癌后Mint3低水平患者生存率高于高水平患者,差异有统计学意义(χ2=11.272,P<0.001)。见图4。

图4 Mint3表达相关生存曲线

3 讨论

多项研究表明Mint3在病理条件下可作为癌细胞、巨噬细胞以及癌症相关成纤维细胞中的HIF-1的激活剂[8],而HIF-1在各种实验模型中对癌症发生发展以及治疗均具有重要作用[9,10]。同时有研究证实敲除Mint3的小鼠表现出对癌症的抑制转移,且Mint3缺失可抑制乳腺癌、肺癌、胰腺癌以及纤维肉瘤等各类型癌症的肿瘤生长,增强癌细胞的化学敏感性[11-13],但是Mint3在肝癌发生发展中的相关研究目前较少。而本研究通过对肝纤维化患者进行动态监测血清内Mint3含量,发现以发生肝癌为结局的患者随访3年内Mint3含量显著高于未发生肝癌的患者,且发生肝癌组患者随着肝纤维化的加重Mint3含量随之增加。同时本研究还发现发生肝癌患者中死亡患者血清中Mint3含量显著高于存活患者。提示Mint3可能与肝纤维化的发生和发展密切相关,监测Mint3可能对肝纤维化的治疗和疾病进展具有重大意义,Mint3有希望作为肝纤维化进展为肝癌的标记物。

肝纤维化是慢性乙型肝炎病变的基础,肝内炎症活动造成肝细胞持续损伤以及肝结构遭到破坏,进而进展为肝癌[14]。研究发现Mint3在病毒感染巨噬细胞时被显著诱导[15]。而Mint3可通过促进K63链接的TNF受体相关因子3多泛素化进一步增强使乙型肝炎病毒感染巨噬细胞加重,而Mint3也会被进一步增强诱导,表达率增加[16,17]。也有研究发现Mint3在不同肝纤维化患者中差异化表达的原因可能与其通过与FIH-1结合激活HIF-1,进而干扰FIH-1与HIF-1之间相关作用有关[18]。且已有研究证实Mint3可在某些类型的癌细胞中与FIH-A相互作用[19]。本研究患者穿刺肝组织进行免疫组化结果显示,Mint3在未发生肝癌患者肝组织中表达显著高于发生肝癌患者,这说明高Mint3水平肝纤维化患者发生肝癌的概率更高,且高Mint3水平发生死亡的风险也更高。提示Mint3可能对肝纤维化进展为肝癌和肝癌加重死亡具有重要预示意义。另外本研究通过相关性分析发现Mint3含量与肝纤维化患者是否发生肝癌、发生肝癌患者是否死亡、LN、HA、PC-Ⅲ、Ⅳ-C、AFP具有显著正相关性,进一步证实了Mint3在肝纤维化进展为肝癌过程中发挥重要作用。并且我们通过相关性分析发现Mint3和HA、LN、PC-Ⅳ、Ⅴ-C以及AFP都是肝纤维化患者发生肝癌的危险因素。因此我们推测Mint3有可能是肝纤维化发生肝癌及肝癌死亡的监测标志物,另外本研究ROC曲线结果显示,Mint3值预测肝纤维化发生肝癌的AUC值、灵敏度和特异度均较高,预测肝纤维化发生肝癌死亡的AUC值、灵敏度和特异度也较高。这进一步提示Mint3对肝纤维化进展为肝癌的潜在诊断价值。最后我们通过生存曲线证实肝纤维化患者发生肝癌后Mint3低水平患者生存率高于高水平患者。提示肝纤维化患者肝组织Mint3水平可能与肝纤维化进展为肝癌以及肝癌患者生存情况有关,但由于本研究样本量较少,此结果具有一定局限性,有待临床做进一步研究证实。

综上所述,在肝纤维化患者病情进展过程中,Mint3水平与肝纤维化进展密切相关,Mint3升高可能能促进肝纤维化进展为肝癌,监测Mint3值有助于肝纤维化进展为肝癌的早期诊断以及预后。