鉴定LTBP1 作为胃癌预后的生物标志物及其与肿瘤免疫微环境的相关性

王小瑞 ,王觅柱

1包头市第四医院消化内科 内蒙古自治区包头市,014030

2内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院消化内科 内蒙古自治区包头市,014030

胃癌是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率居恶性肿瘤的第五位[1-3]。胃癌早期通常无症状,有些患者诊断时已处于晚期,生存率仅为24 %[4-6]。近年来,一些治疗晚期胃癌的靶向药物已被开发并批准用于临床,包括曲妥珠单抗、雷莫昔单抗和帕博利珠单抗[7-9]。然而,胃癌患者的总体预后仍然较差。在中国,胃癌的发病率和死亡率均位居第三。全球每年新发胃癌病例中,中国约占其中的40 %。我国早期胃癌占比很低,仅约20 %,大多数发现时已是进展期,总体5 年生存率低于50 %,以手术为基础的综合治疗仍是胃癌的主要治疗方法[10]。一些研究表明,胃癌患者术后的中位生存时间仅为37～43 个月,术后随访27.8 个月,复发率高达36.8 %,其中大部分为远处转移[11-13]。

潜在转化生长因子β 结合蛋白1 (latent transforming growth factor beta binding protein 1,LTBP1)作为一种分泌蛋白,是细胞外基质的重要组成部分,属于转化生长因子-β 蛋白家族成员,具有独特的结构域激活TGF-β 信号通路,发挥多种生物学功能[14]。研究发现,LTBP1 促进食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC) 的肿瘤发生与进展[15],并且可能通过调控细胞外基质(extracellular matrix,ECM) 介导了抑郁症与恶性胶质瘤的发生进展[16],而在宫颈癌中有发现LTBP1 的降低与肿瘤恶性进展有关[17]。此外,LTBP1与AFP 合用可以更好的诊断和预测肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)[18]。但是LTBP1在胃癌中的生物学功能研究仍不多。有研究发现,在胃神经内分泌癌中的部分样本中检测到LTBP1 的突变[19],另一项研究表明,LTBP1 的高表达可能与微卫星不稳定性高的胃癌患者总生存率低相关[20]。本研究主要探索LTBP1 与胃癌发生发展的关系,为LTBP1 应用于胃癌靶向治疗提供新的视角。

1 材料与方法

1.1 TCGA 中胃癌测序数据的处理

在R 软件中使用limma 包来标准化矩阵数据,并在每个数据集中识别肿瘤组织和癌旁组织之间的差异表达基因(DEG)。使用Benjamin Hochberg 方法调整P值。调整后的P＜0.05 和| log2 倍数变化| ＞1 表明基因差异具有统计学意义。

1.2 患者和组织样本

胃癌组织芯片HStm-Ade150 CS-01 购买于上海芯超生物公司,该组织芯片包含75 例胃癌组织及癌旁组织,所有组织的收集都获得患者的知情同意,组织芯片的使用已获得样本伦理使用审查(YBM-05-02)。将胃癌石蜡切片脱蜡至水。在室温下用3 %过氧化氢孵育5 min,以消除内源性过氧化物酶的活性。用蒸馏水冲洗,在PBS 中浸泡5 min,重复两次。用10 %山羊血清(用PBS 稀释) 封闭,室温孵育10 min,小心倒出血清,加入一抗工作液,4 ℃孵育过夜。用PBS 冲洗5 min,重复3 次。滴加1 mL生物素标记的二抗工作液,37 ℃孵育20 min。用PBS 洗涤5 min 并重复3 次。滴加1 mL 辣根酶标记的链霉亲和素工作溶液,在37 ℃下孵育20 min。用PBS冲洗5 min,重复3 次。显影剂显色后,每隔30 s 立即在显微镜下观察是否有染色(DAB),2 min 后变为灰褐色时表示染色成功。用自来水充分冲洗,复染,脱水,透明并密封薄膜。

1.3 TIMER 分析LTBP1 与免疫细胞的相关性

利用TIMER (Tumor Immune Estimation Resource) 免疫浸润分析在线网站,在基因模块中输入LTPB1 基因表达水平和免疫标记基因列表,并将它们分组以进行进一步的参数设置,分析LTBP1与肿瘤免疫B 细胞、T 细胞、Th1 细胞,Treg 细胞的相关系数。

1.4 生存和预后分析

为了验证关键基因的可靠性,我们使用在线工具GEPIA22 验证了TCGA-STAD 数据中肿瘤组织和正常组织中关键基因的mRNA 表达水平。然后,基于TCGA-STAD 数据,我们使用R 软件中的生存包进行Kaplan-Meier 单变量生存分析,以探讨患者的总生存率(OS) 与关键基因之间的关系。在这项研究中,只选择完成随访时间的患者进行生存分析,然后根据关键基因的表达中值分为两组。与预后相关的关键基因(P＜0.05) 被认为具有统计学意义。

1.5 统计分析

使用R 软件版本4.0.2 (https://www.r-project.org/) 处理实验数据。测量数据表示为。独立样本采用独立样本t检验,配对样本采用配对样本t检验。Kaplan-Meier 生存率分析采用对数秩检验。P＜0.05 表明差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LTBP1 在胃癌中的表达及临床意义

泛癌分析结果显示,LTBP1 在TCGA 的33 种肿瘤中均有表达(图1A)。LTBP1 在肿瘤组织中的表达水平显著高于其在癌旁组织中的表达(图1B)。在配对的胃癌样本中LTBP1 也显著高表达(图1C)。

图1 LTBP1 在胃癌中的表达分析

应用ROC 分析验证LTBP1 的潜在诊断价值,并计算LTBP1 ROC 曲线下的面积。ROC 曲线下的面积为0.733,表明LTBP1 可能是一种潜在的诊断标志物(图1D)。

2.2 LTBP1 表达与胃癌的临床相关性

我们比较了LTBP1 表达与患者临床病理关系特征的相关性。结果显示,与T1 期患者相比,LTBP1 在T1、T2 和T3 期患者中表达也逐渐升高(图2A),病理分期中也出现了一致的结果,在恶性高的Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期中表达升高(图2B),LTBP1 在M0 和M1 期患者中的表达无显著差异(图2C)。这些结果表明,LTBP1 的高表达与胃癌的恶性进展密切相关。

图2 LTBP1 表达与胃癌临床参数相关性分析

2.3 LTBP1 表达与胃癌预后的关系

使用“survminer” 软件包绘制的Kaplan-Meier图评估LTBP1 在胃癌中的预后价值。结果显示,LTBP1 的高表达与总生存期缩短[HR=1.46 (1.05～2.03),P=0.026] 和无进展生存期缩短[HR=1.35 (0.95～1.93),P=0.038] 相关(图3)。

图3 LTBP1 表达与胃癌患者生存预后的关系

2.4 LTBP1 表达与胃癌免疫浸润的相关性

采用Spearman 相关分析法对胃癌患者肿瘤微环境中LTBP1 的表达水平与TIMER 定量的免疫浸润进行相关性分析。

我们分析了T 细胞、B 细胞、Treg 和Th1 细胞与LTBP1 表达之间的相关性,首先我们发现LTBP1 在T 细胞、B 细胞和Th1 细胞富集分数高的组中高表达,具有统计学差异,与调节性T 细胞(Treg) 富集分数无显著差异。进一步分析发现,发现LTBP1 的表达与T 细胞、B 细胞、Th1 细胞和Treg 细胞的浸润相关系数分别为0.203、0.289、0.182 和0.061,统计学分析显示LTBP1 的表达与T 细胞、B 细胞、Th1 细胞显著正相关,差异具有统计学意义(图4)。

图4 TIMER 定量分析LTBP1 与胃癌免疫细胞浸润关系

2.5 评估LTBP1 表达作为胃癌预后标志物

为了进一步验证LTBP1 蛋白在胃癌中的表达情况,我们在75 例胃癌患者及配对癌旁组织进行免疫组织化学染色,结果表明,与癌旁组织相比,LTBP1 在胃癌组织中高表达(图5)。

图5 免疫组化检测LTBP1 在胃癌及胃癌旁组织中的表达情况(200 ×)

3 讨论

胃癌是世界上发病率较高的恶性肿瘤,被发现时大多处于晚期。晚期胃癌患者预后较差,对化疗不敏感[21-22]。因此,寻找有效的生物标志物对预测胃癌预后和作为潜在靶点具有重要意义。LTBP1是一类具有多种生物学功能的分泌蛋白,通过其自身的EGF 结构域调节TGF-β 的活化。TGF-β 的异常活化与多种疾病的发生特别是肿瘤的发生相关。

LTBP1 在胃癌中的研究不多,作用尚不明确。本研究通过综合生物信息学分析,结合TCGASTAD 分析了LTBP1 在胃癌的表达情况,我们发现LTBP1 高表达于胃癌样本,此外通过比较LTBP1在GTEx 数据库及TCGA 数据库中正常样本和胃癌患者样本中的表达,发现LTBP1 在胃癌患者样本中高表达。ROC 曲线表明LTBP1 具备潜在的胃癌诊断价值。接下来,我们进一步比较了LTBP1 表达与患者临床病理关系特征的相关性并对LTBP1在胃癌中的预后价值进行评估,我们发现LTBP1的表达与TNM 分期和组织学分级有一定的相关性,且LTBP1 的上调与胃癌总体生存率期和无进展生存期缩短显著相关。我们通过免疫组织化学染色进一步在75 例胃癌组织及配对癌旁组织中检测了LTBP1 的表达,进一步验证了LTBP1 在胃癌中的表达水平显著高于癌旁组织。此外,通过TIMER我们进行了LTBP1 表达与胃癌中免疫细胞浸润情况的分析,我们发现LTBP1 的表达与T 细胞、B细胞、Treg 和Th1 细胞的浸润具有相关性。这些结果证实了LTBP1 在胃癌组织中高表达,且和胃癌的临床特征密切相关。但是LTBP1 促进胃癌的分子生物学机制还需进一步研究。未来我们将继续分析和探讨LTBP1 在胃癌的发生发展中的可能机制,以提高胃癌的筛查和早期诊断,改进治疗方法,减少复发和转移。