猪繁殖与呼吸综合征对塞内卡病毒灭活苗免疫效果的影响

汤笑语,张丽燕,邱文英,陈奕帆,马明昊

(华派生物技术(集团)股份有限公司,成都 641423)

A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)是一种小RNA病毒科(Picornaviridae),塞内卡病毒属(Senecavirus)的单股正链RNA病毒[1]。SVA能够感染不同年龄段猪,引起猪的原发性水疱病,SVA感染的临床症状与口蹄疫、水疱性口炎、猪水泡病相似,主要表现为猪鼻部、口唇部、蹄部出现水泡病变甚至溃烂,新生仔猪感染SVA还可能会导致死亡[2-3]。2015年广东省首次报道猪感染SVA后,直至今日,SVA已在我国广泛流行,但目前还没有商品化疫苗用于该病的防控[4-7]。猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)又称蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的一种免疫抑制性疾病,该病传染性强,发病率高,严重危害了养猪业的发展[8-10]。蓝耳病的免疫抑制作用不仅会导致感染猪继发其他细菌性疾病,加重病程,还会致使其它疫苗的免疫反应降低,导致免疫效果降低或免疫失败[11-13]。已有研究表明多种疾病疫苗的免疫效果都会受到蓝耳病的影响,如猪瘟、猪口蹄疫等[14-15]。本研究通过同时对PRRS阳性猪和PRRS阴性猪免疫塞内卡灭活苗,检测其中和抗体效价及攻毒保护情况,探究PRRS是否会影响SVA灭活苗的免疫效果,为SVA和PRRSV的防控以及疫苗研发提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与病毒 猪塞内卡病毒(A/ZJ/2015株),由中国农业科学院兰州兽医研究所分离、鉴定,由华派生物技术(集团)股份有限公司鉴定、保管及供应。仓鼠肾细胞(BHK-21),由华派生物技术(集团)股份有限公司质管部保存。

1.1.2 主要试剂 SVA灭活疫苗由华派生物技术(集团)股份有限公司制备,MEM培养基、胰蛋白酶购自GIBCO;新生牛血清购自内蒙古金源康生物工程材料有限公司;高效率逆转录试剂盒购自东洋纺(上海)生物科技有限公司;2×Taq PCR预混试剂购自天根生化科技(北京)有限公司;PBS缓冲液由华派生物技术(集团)股份有限公司实验室配制。

1.1.3 引物 PRRSV鉴定引物PRRSV-F/PRRSV-R及SVA鉴定引物SVA-F/SVA-R序列如表1所示,所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限合成,由华派生物技术(集团)股份有限公司保存。

表1 引物的序列Tab 1 Sequence of primers

1.2 方法

1.2.1 试验动物的筛选 35～42日龄仔猪5头,SVA抗原阴性、PRRSV抗原阳性,SVA抗体阴性(中和抗体效价小于1∶4);猪场半年内未免疫PRRSV活疫苗。35～42日龄仔猪10头,SVA、PRRSV抗原阴性,SVA抗体阴性(中和抗体效价小于1∶4)。

1.2.2 试验动物分组及免疫方案 如表2所示,A组为PRRS阳性组,B、C组为PRRS阴性组;A、B组免疫SVA灭活疫苗,每头2.0 mL,C组为对照组,免疫相同体积生理盐水,间隔2周后以同样剂量加强免疫一次。

表2 动物分组及免疫方案Tab 2 Animal grouping and immunization program

1.2.3 SVA中和抗体效价检测 采集试验仔猪免疫后7 d、14 d、21 d、28 d的血液并分离血清,血清经56 ℃、30 min灭活后进行中和抗体效价测定。

将2倍系列稀释的待检血清加入96孔细胞培养板,每个血清样品平行做4孔,50 μL/孔,之后每孔加50 μL含200 TCID50的SVA病毒液,置于37 ℃中和1 h;每孔加100 μL BHK-21细胞悬液(2×105/mL～3×105/mL),置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养,72～96 h判定结果。同时设阴、阳性血清对照,病毒对照和细胞对照;阴性血清与待检血清同倍稀释,阳性血清稀释至32倍中和抗体效价。当病毒对照组及阴性血清对照组均出现细胞病变4/4孔,细胞对照组及阳性血清对照组均出现细胞病变0/4孔时,试验成立。以能抑制50%以上细胞出现细胞病变的血清最高稀释度的倒数判定为该血清抗体效价的滴度。

1.2.4 攻毒保护试验 免疫后28 d,用SVA病毒液(A/ZJ/2015株,F10代)进行攻毒,颈部肌肉注射,4.0 mL/头(108.8TCID50/mL)。试验猪攻毒后10 d内四蹄中任一蹄或鼻镜出现水疱或者溃疡均判为发病,部分试验猪可能伴有精神沉郁、食欲差等症状。试验猪攻毒后10 d内四蹄、鼻镜均未出现水疱或者溃疡,精神、食欲正常,如出现精神沉郁、食欲差等临床症状,应持续不超过2 d,即判为保护。

2 结果与分析

2.1 试验动物的筛选 将初步筛选的仔猪采集全血,提核酸并反转录后采用SVA鉴定引物SVA-F/SVA-R及PRRS鉴定引物PRRSV-F/PRRSV-R对仔猪进行抗原检测。如图1所示,所有试验猪SVA阴性,A组5头试验猪(泳道19-23)PRRSV全部阳性,其余全部PRRSV阴性,符合试验要求。将A组阳性血清样本PCR扩增测序后进行同源性分析,结果显示A组试验猪感染的PRRSV(将其命名为SC-PRRSV)与高致病性毒株GXNN1409、JXA1等亲缘关系较近(图2),判定A组PRRSV阳性猪为高致病性野毒感染。

M:Marker;1:SVA阴性对照;2-16:15头试验猪样品SVA检测;17:SVA阳性对照;18:PRRSV阴性对照;19-33:15头试验猪样品PRRSV检测;34:PRRSV阳性对照图1 试验动物筛选PCR鉴定结果Fig 1 PCR test result of experimental animal screening

图2 SC-PRRSV系统发育进化树分析Fig 2 Phylogenetic tree analysis of SC-PRRSV

2.2 血清中和抗体效价 检测所有试验猪免疫后7 d、14 d、21 d、28 d的血清中和抗体效价,结果如表3所示,PRRS阳性组(A组)及对照组(C组)仔猪免疫后血清中和抗体效价均<1∶4,而PRRS阴性组(B组)仔猪免疫后21 d开始出现较高效价,最高可达1∶512,免疫后28 d抗体水平较免疫后21 d开始下降,但大多数也维持在较高水平(1∶64～1∶256)。

表3 试验猪血清中和抗体效价结果Tab 3 Result of pig serum neutralizing antibody titer

2.3 攻毒保护情况 免疫后28 d对所有试验猪进行攻毒,连续10 d观察试验猪临床症状。攻毒保护结果如表4所示,PRRS阳性组(A组)1头仔猪攻毒后4 d蹄部开始出现水疱症状(图3A),攻毒后6 d所有仔猪均发病;PRRS阴性组仔猪攻毒后连续10 d都未出现临床症状(图3B);对照组2头仔猪攻毒后4 d蹄部开始出现水疱(图3C),攻毒后6 d全部发病。

A:PRRS阳性组(A组);B:PRRS阴性组(B组);C:对照组(C组)图3 SVA攻毒后蹄部病变图Fig 3 Hoof lesion after SVA challenge

表4 试验猪攻毒保护结果Tab 4 Result of protection against virus challenge

3 讨 论

疫苗免疫作为猪场防控各种病毒感染的有效手段之一备受重视,然而免疫失败的案例仍屡见不鲜。猪疫苗免疫失败的原因除了一些常见因素如疫苗本身免疫原性差、免疫方式错误、母源抗体影响、饲养管理不科学外,PRRS等免疫抑制性疾病也是重要因素[16-17]。本试验对PRRS阳性猪和PRRS阴性猪免疫了相同剂量的SVA灭活苗,分别于首次免疫后7 d、14 d及加强免疫后7 d、14 d采集血清检测中和抗体效价,结果显示免疫组5头PRRS阳性猪所有血清均无中和抗体效价,而5头PRRS阴性猪中有1头在首次免后14 d就开始出现效价,加强免疫后所有健康猪抗体效价上升到较高水平,最高可达1∶512。攻毒保护结果与中和抗体效价结果呈正相关,PRRS阳性组及对照组5头试验猪全部发病,而PRRS阴性组试验猪达到5/5保护。PRRS阴性组仔猪的中和抗体效价结果及攻毒保护结果表明了该SVA灭活苗有良好的免疫原性,能够对SVA感染提供免疫保护。PRRS阳性组免疫与PRRS阴性组相同批次,相同剂量的塞内卡灭活苗时,所有试验猪中和抗体效价均小于1∶4,并且不能产生免疫保护,表明PRRS影响了SVA的抗体应答。

本研究首次证明了PRRS会影响SVA灭活疫苗的免疫效果,有研究表明PRRS也会导致其它疫苗免疫效果的下降,如在陈鹏[14]等人2018年的研究中,证明了PRRS会导致商品化猪O型口蹄疫浓缩苗免疫合格率下降;在张艳娜[15]等人的研究中发现PRRS野毒感染会显著降低猪瘟兔化弱毒疫苗的免疫效果。PRRS会降低其它疫苗的免疫效果对我们有很多启示。首先,我们对于PRRS的日常监控不可松懈,当猪场存在病情或监测到抗原时,应当加强饲养管理,采取药物等手段提高猪的免疫力后再进行疫苗免疫。其次,制定合理的免疫程序也至关重要,虽然有部分实验表明同时免疫猪瘟疫苗与PRRSV活疫苗时,免疫效力不会产生影响,甚至还具有诱导快速、增强和持久免疫反应的优势,但PRRSV活疫苗是否会对其他疫苗的免疫反应造成影响还不清楚[18-19]。最后,从疫苗的研发来看,这也对研制出安全有效、不影响其它疫苗免疫效果的PRRSV活疫苗提出了挑战。