通过式固相萃取结合高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱测定鸡蛋中62种兽药残留

侯 轩,王 彬,刘爱军,黄晓兵,柴 娟,张航俊,陆春波

(浙江省动物疫病预防控制中心,杭州 310000)

随着物质生活水平的逐渐提高,人们对食品质量安全也越来越重视,其中畜产品兽药残留问题受到了社会各界的关注。鸡蛋作为一种重要的动物性食品,能够为人们提供大量的蛋白质以及各种维生素[1],在人们日常饮食中占有重要的地位。在蛋鸡养殖过程中,抗生素作为一类天然、半合成或人工合成的化合物,因其具有促进动物生长、减少疾病发生率、提高饲料利用率等优点而广泛使用[2],但若其使用不当则会造成鸡蛋抗生素残留超标。抗生素残留通过食物链富集进入人体后,会危害人类健康。目前我国已制定了一系列兽药限量标准[3-4],对其用于畜禽动物的养殖加以限制或禁止,但兽药品种繁多,如何同时快速甄别与确证鸡蛋中多种抗生素残留,保障消费者健康安全显得意义重大。因此,针对鸡蛋建立一套高通量、高灵敏度、快速准确的兽药多残留测定方法具有重要的实际应用价值。

目前,动物源性食品中抗生素检测方法主要有免疫分析法[5-6]、高效液相色谱法[7-8]、气相-串联质谱法[9-10]、液相-串联质谱法[11-13]等。其中,液相色谱-串联质谱法(LC-MS / MS)因其具有高通量、高灵敏度、抗干扰能力强的特点,越来越多地被广泛应用于食品中兽药残留的检测,但LC-MS / MS受限于其扫描速率及分辨率,对于同时测定多组分兽药分析的效果不佳。飞行时间质谱作为一类高分辨质谱,由于具有更快的扫描速率和更高的分辨率[14-16],在抗基质干扰能力方面表现更强,可同时实现对数百种化合物的快速筛查和分析,进一步提高检验效率。

本研究拟采用通过式固相萃取样品前处理技术,该技术可同时减少鸡蛋中蛋白质、脂质、色素等杂质干扰,有效降低基质效应,还可免除活化与平衡步骤,减少前处理时间与成本,适合多组分检测时大规模样品的净化。同时结合高分辨质谱检测的优势,可对8大类62种兽药化合物进行同时测定,建立一套快速准确的筛查确证分析方法。本方法具有简便快捷、覆盖目标物范围广、通量高且准确可靠的特点,适用于大批量鸡蛋中痕量兽药多残留的快速筛查与确证分析。

1 材料与方法

1.1 试剂与耗材 甲醇、乙腈(色谱纯,Mecrk公司);甲酸、乙酸铵(色谱纯,阿拉丁公司);PRiME HLB 固相萃取小柱(200 mg/6 mL,Waters 公司);聚四氟乙烯针式滤膜(0.22 μm,Green Mall公司)等。

62种兽药标准物质(喹诺酮类13种、磺胺类21种、大环内酯类10种、硝基咪唑类6种、酰胺醇类3种、硝基呋喃类4种、喹噁啉类4种、林可胺类1种)分别购于德国Dr. Ehrenstorfer公司、美国Sigma公司和中国食品药品检定研究院。

1.2 仪器与设备 Agilent 1290-6550高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪(配双喷雾器电喷雾源),美国Agilent公司;Agilent MassHunter软件工作站,美国Agilent公司;XS205分析天平,美国Mettler Toledo公司;KQ-500E超声仪,昆山市超声仪有限公司等。

1.3 样品前处理 称取已均质的鸡蛋样品2±0.02 g于50 mL离心管中,准确加入10 mL甲酸乙腈溶液(甲酸、乙腈、水体积比为0.1∶90∶10),涡旋振荡提取1 min,超声提取10 min,10000 r/min离心5 min,收集全部上层提取液过PRiME HLB固相萃取柱,收集滤液,准确吸取5 mL 滤液于另一带刻度离心管中,40 ℃氮气吹至1 mL以下,残渣用0.2%甲酸水定容至1.0 mL,过0.22 μm 滤膜后,供 HPLC-QTOF测定。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件 采用Waters ACQUITY T3,1.7 μm,100 mm×2.1 mm色谱柱,柱温25 ℃,进样量2 μL,流动相条件见表1。

表1 HPLC-QTOF流动相条件Tab 1 HPLC-QTOF Mobile Phase Conditions

1.4.2 质谱条件 质谱采用Dual AJS ESI源,扫描方式为正离子、负离子全扫描。电离源温度120 ℃,毛细管电压3000 V,喷嘴电压200 V,干燥器温度250 ℃,鞘气温度320 ℃。一级质谱数据采集为全扫描模式,扫描范围:m/z100～1 000 Da,采集速率为1.5 spectra/s。二级质谱数据采集为目标离子采集模式,碰撞能量为 10、20和40 eV,扫描范围:m/z50～1000 Da,采集速率为2.5 spectra/s。采集数据的同时连续导入参比溶液,对仪器质量轴进行实时校正,参比离子为m/z121.0509和m/z922.0098。62种化合物质谱参数见表2。

表2 62种化合物测定信息Tab 2 Determination Information of 62 Compounds

1.4.3 高分辨质谱库的建立 针对62种待测化合物,在Agilent MassHunter软件工作站项下的谱图数据库软件(PCDL)中录入各化合物的中文名称、CAS号、分子式等基本信息;采用本研究建立的液相、质谱条件对62种化合物标准溶液进行测定,得到各化合物的保留时间、母离子精确质量数、子离子特征图谱等信息,将所有信息导入PCDL中,建立62种化合物高分辨质谱谱库。

2 结果与分析

2.1 液相色谱条件的优化 考察了流动相组分、比例对待测化合物测定的影响。本研究流动相A为含5 mmol/L乙酸铵的0.2%甲酸水溶液,B相为含5 mmol/L乙酸铵的0.2%甲酸甲醇溶液,分别采用0.1%和0.2%甲酸添加量进行了分析,发现0.2%的甲酸水乙酸铵溶液和甲酸甲醇溶液做流动相所得化合物的峰型更好。由于此方法筛选的化合物种类较多,各种药物的极性强弱、在色谱柱上保留强度以及洗脱的时间长短均不相同,若使用等度洗脱的方法无法得到非常理想的峰形,因此本研究选择梯度洗脱,具体色谱条件见表1。

2.2 质谱条件的优化 配制浓度为20 ng/mL的62种化合物的混合标准溶液,优化最佳的电离源温度、毛细管电压、鞘气温度、干燥器温度等质谱条件,用HPLC-Q-TOF测定。采用MS全扫描模式采集各化合物的一级质谱信息,Target-MS/MS模式采集二级质谱信息,确定了62种化合物的实测母离子精确质量数、保留时间、特征子离子精确质量数等质谱参数,具体见表2。

2.3 基质效应考察 鸡蛋脂类、蛋白丰富,在化合物质谱分析中可能出现基质效应的情况。对62种化合物在鸡蛋中基质效应情况进行了考察。其中,酰胺醇类、喹噁啉类药物表现为基质抑制效应。为保证实验结果的准确,本研究采用基质匹配标准曲线以消除或减弱基质效应对定量分析结果的影响。

2.4 定量方法确定 为获得准确可靠的定量结果,待测样品采取全扫描模式(FULL-MS)进行初步筛查后,疑似阳性样品采取目标离子模式(Target-MS)进行二级质谱数据采集,该模式利用三重四极杆对目标化合物的母离子进行选择与裂解,确保扫描速率与扫描时间的同时,可有效减少杂质干扰、提高检测灵敏度,保证定量结果准确。

2.5 标准曲线、检出限及定量限 按1.3项处理空白样品后,采用鸡蛋空白提取液配制 62种化合物的标准工作液,供HPLC-QTOF检测。以目标化合物色谱峰面积及其对应化合物浓度绘制标准曲线,获得待测物质的线性回归方程,取信噪比S/N=3的样品浓度为方法检出限(LOD),取信噪比S/N=10 的样品浓度为方法定量限(LOQ)。62种化合物浓度在 0.5 ～500 ng /mL 范围内,鸡蛋中 62 种化合物的线性关系良好(r2≥0.99),方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别在 1.0～ 2.0 μg / kg 和 2.0 ～5.0 μg / kg 范围内,均满足检测需求。

2.6 方法的回收率、精密度 分别在各化合物定量限、2倍定量限及10倍定量限浓度添加水平下进行添加回收实验,每个浓度设5个平行,重复3次。计算添加回收率及变异系数,结果见表3。

表3 鸡蛋中62种化合物的回收率(n=5)Tab 3 Recovery rates of 62 compounds in eggs (n=5)

2.7 实际样品检测 应用建立的分析方法,对浙江省内市面上售卖的150份鸡蛋样品进行测定,其中1批次鸡蛋检出恩诺沙星,含量为5.3 μg/kg。该检测结果表明,本方法能满足对鸡蛋中62种化合物有效监控的需要。

3 讨论与小结

3.1 液相条件的优化 因待检化合物存在同分异构体,仅靠质谱分析很难将所有化合物有效定性,故对液相条件进行了优化。一是考察了流动相组成对化合物灵敏度和离子化效率的影响,发现在流动相中添加0.1%甲酸及5 mmol/L乙酸铵,可以有效提高化合物在正离子和负离子模式下的离子化效率,提高灵敏度。二是对流动相比例进行了考察,发现采用梯度洗脱能保证待测化合物的有效分离。如待测化合物磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶为同分异构体,分子式为C11H12N4O3S,采取1.4.1项液相条件进行分析,保留时间分别为8.94、9.29、10.16 min,得到有效分离,进一步保证化合物定性的准确,具体见图1。

图1 磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶标准溶液(10 ng/mL)Fig 1 Sulfameter, Sulfamethoxypyridazine and sulfamethoxypyrimidine Standard solution(10 ng/mL)

3.2 提取条件的优化 本研究对纯乙腈、乙腈:水:甲酸(90∶10∶0.1,V/V/V)、乙腈:水:甲酸(80∶20∶0.1,V/V/V)3种提取剂进行了考察。3种提取剂对8大类62种兽药的提取效果,见图2。结果表明,乙腈-水体系提取效率明显高于纯乙腈,可能是乙腈乙腈-水体系有效沉淀蛋白的同时,还具有更强的渗透力,可有效提取基质中的待测化合物;90% 甲酸乙腈水溶液提取效果与80%甲酸乙腈水溶液提取效果差别不大,但提取液过Prime HLB小柱后还需氮吹,考虑到氮吹效果,减少氮吹时间,选择乙腈:水:甲酸(90∶10∶0.1,V/V/V)作为提取液。

图2 不同提取液提取效率(添加浓度为 10 μg/kg)Fig 2 Extraction efficiency of different extraction solutions (added concentration of 10 μg/kg)

本研究采用通过式固相萃取与高分辨质谱技术相结合的检测方式,建立了同时测定鸡蛋中62种兽药残留的分析方法,并进行了方法学验证,回收率在71.2%～113%之间,日内变异系数范围为1.3%～14.3%,日间变异系数范围为4.2%～18.3%,检测限为1.0～2.0 μg/kg,定量限为2.0～5.0 μg/kg。本方法操作简便,灵敏度高,适用于大批量鸡蛋中痕量兽药多残留的快速测定。