miR-451a在肺结核患者血清中的表达水平及临床意义

赵勇, 梁丽丽, 江南

1商丘市胸科医院结核科(河南商丘 476005); 河南省胸科医院 2结核内科, 3结核外科(河南郑州 450008)

结核病是一种通过吸入结核分枝杆菌(MTB)传播的慢性传染病,不仅会感染患者肺部,还可累及多个器官及组织[1]。我国在2020年已成为结核第2负担国,新发病例为82.5万,防控形势较为严峻[2]。活动性肺结核(ATB)是结核病的主要传染源,其病灶处于活动期,痰涂片阳性,病程进展快,且该类患者多存在耐药性,病死率高[3]。因此,急需筛选可用于评估ATB治疗效果的标志物,以助于改善预后。众所周知,ATB发病过程与免疫功能紊乱有关,多种炎症因子、异常表达的微小RNA(miRNA)均参与其中[4]。微小RNA(miR)miR-451a在肺结核患者血清中水平降低,通过调控免疫应答过程中关键基因表达参与巨噬细胞抗MTB感染过程[5]。Toll样受体4(TLR4)位于巨噬细胞表面,当MTB入侵时,激活TLR4信号通路,并将信号传递到细胞内,激活免疫应答,机体大量分泌炎症因子,消灭MTB[6]。已证实,miR-451a可靶向调控TLR4信号通路,参与MTB感染过程[7]。但miR-451a与ATB患者抗结核治疗预后的关系尚未明确。本研究通过检测ATB患者血清miR-451a、TLR4 mRNA水平,分析其与炎症反应及预后相关性,以改善抗结核治疗效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2020年2月至2022年10月商丘市胸科医院收治的肺结核患者350例,其中ATB患者162例(ATB组),非ATB患者188例(NATB组)。另取同期健康体检者180例为对照组。ATB组依据抗结核6个月疗效分为预后良好组(n=120)、预后不良组(n=42)。本研究经医院伦理委员会批准(编号:2020-02-025)。

纳入标准:(1)符合ATB相关诊断标准[8],具有盗汗、咯血、发热等体征,痰抗酸杆菌阳性,影像学检查提示ATB病变特征;(2)初次确诊;(3)肝肾功能正常;(4)单一肺结核感染。

排除标准:(1)未完成随访;(2)慢性支气管炎、慢阻肺等其他肺部疾病;(3)恶性肿瘤;(4)自身免疫性疾病;(5)耐药性肺结核、肺外结核;(6)呼吸道病毒急性感染等其他急、慢性感染性疾病。

1.2 方法

1.2.1 临床资料 统计入组受试者人口学资料性别、年龄、体质指数(BMI)等,实验室指标:白细胞计数(WBC)、C反应蛋白(CRP)、红细胞沉降率(ESR)、干扰素-γ(IFN-γ),白细胞介素-12(IL-12)。其中WBC采用全自动血细胞分析仪(BC-6900型,深圳迈瑞公司)检测,ESR采用魏氏法,CRP、IFN-γ、IL-12利用检测试剂盒在全自动生化分析仪(罗氏C702)测定,货号为H126-1-2、H025-1-2、H010,均由南京建成生物工程研究所提供。

1.2.2 血清miR-451a、TLR4水平检测 取对照组体检当天、肺结核患者入院次日清晨空腹外周血5 mL,高速离心肌(型号Centrifuge 5810R,Eppendorf公司)3 000 r/min转速,离心10 min,取血清,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测血清miR-451a、TLR4 mRNA表达。使用TRIzol试剂(货号15596-062,美国Invitrogen公司)从血清中获得总RNA,利用第一链cDNA合成预混体系Master Premix(货号:RT-01022,重庆致宏生物科技有限公司)得到互补DNA,随后采用一步法RT-qPCR试剂盒(货号:RT-02111,重庆致宏生物科技有限公司)说明书进行RT-qPCR反应,QuantStudio 3荧光定量PCR仪为美国ABI公司。PCR扩增程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,共计40个循环。引物序列见表1,由上海汉恒生物公司提供合成,miR-451a、TLR4分别以U6、GAPDH作为内参。采用2-ΔΔCt法分析miR-451a、TLR4 mRNA相对表达量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 治疗方案及预后评估

1.3.1 治疗方案 ATB患者均给予标准2HRZE/4HR方案[8],强化期(2个月)给予异烟肼(国药准字H33020938,浙江巨泰药业有限公司)0.3 g/次,1次/d;利福平(国药准字H13022231,浙江万邦药业有限公司)0.45 g/次,1次/d;吡嗪酰胺(国药准字H31020800,上海信谊药厂有限公司)0.75 g/次,2次/d;乙胺丁醇(国药准字H44020758,广东华南药业集团有限公司),0.75 g/次,1次/d;巩固期(4个月)给予异烟肼、利福平,治疗方案同上。

1.3.2 疗效观察 治疗6个月后评估疗效[9]。预后良好:症状体征消失,3次痰涂片转阴,X线检查结果发现病灶部分吸收或完全吸收、消散、空洞闭合。预后不良:症状无明显好转,胸片未正常,痰涂片阳性。

1.4 统计学方法 应用SPSS 25.0软件处理数据,计数资料以例(%)表示,采用2检验;计量资料以表示,两组间比较采用t检验,3组间比较采用单因素方差分析,两两比较为SNK-q检验;Pearson法进行相关性分析;多因素logistic回归分析ATB患者预后影响因素;受试者工作特征(ROC)曲线评价血清miR-451a、TLR4对ATB患者预后预测价值,ROC曲线下面积(AUC)比较采用Z检验;P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组受试者临床资料比较 ATB组CRP、ESR、IFN-γ、IL-12水平高于NATB组、对照组,NATB组又高于对照组(P<0.05);3组间性别、WBC、学历、年龄、居住地、BMI、婚姻状态、吸烟史、基础疾病相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 3组受试者临床资料比较

2.2 3组受试者血清miR-451a、TLR4 mRNA水平比较 ATB组、NATB组、对照组血清miR-451a水平依次升高,而血清TLR4 mRNA水平依次降低(P<0.05)。见表3。

表3 3组受试者血清miR-451a、TLR4 mRNA水平比较

2.3 ATB组血清miR-451a、TLR4 mRNA水平与临床指标相关性 经Pearson分析发现,ATB组血清miR-451a与TLR4 mRNA水平呈负相关(r=-0.519,P<0.05),见图1。血清miR-451a与CRP、ESR、IFN-γ、IL-12呈负相关(r=-0.404、-0.377、-0.435、-0.391,P<0.05),血清TLR4 mRNA与CRP、ESR、IFN-γ、IL-12呈正相关(r=0.469、0.361、0.442、0.384,P<0.05),miR-451a、TLR4 mRNA均与WBC无明显相关性(r=-0.166、0.172,P>0.05),见图2。

图1 血清miR-451a与TLR4 mRNA水平相关性

图2 血清miR-451a、TLR4 mRNA水平与各临床指标相关性

2.4 不同预后组ATB患者临床资料及血清miR-451a、TLR4 mRNA水平比较 与预后良好组相比,预后不良组TLR4 mRNA、IFN-γ、IL-12水平升高,miR-451a水平降低(P<0.05);两组间居住地、年龄、BMI、CRP、ESR、性别、治疗前胸片X线表现、婚姻状态、治疗前临床表现、学历、WRC、吸烟史、基础疾病相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 不同预后组ATB患者临床资料及血清miR-451a、TLR4 mRNA水平比较

2.5 多因素logistic回归分析ATB患者预后影响因素 以ATB患者预后不良为因变量(预后不良=1,预后良好=0),将TLR4 mRNA(实测值)、IFN-γ(实测值)、IL-12(实测值)、miR-451a(实测值)为自变量,代入logistic回归模型,结果显示,TLR4 mRNA、miR-451a是ATB患者预后影响因素(P=0.001、0.009)。见表5。

表5 多因素logistic回归分析ATB患者预后影响因素

2.6 血清miR-451a、TLR4 mRNA水平对ATB患者预后预测效能 血清miR-451a、TLR4 mRNA单独预测ATB患者预后不良截断值分别为0.70、2.01,AUC分别为0.852、0.821,敏感度分别为92.86%、73.81%,特异度分别为73.33%、86.67%,二者联合检测的AUC为0.949,优于单一指标检测AUC(Z=2.827、2.896;P=0.005、0.004),其敏感度为92.86%,特异度为85.83%。见图3。

图3 血清miR-451a、TLR4 mRNA预测ATB患者预后的ROC曲线

3 讨论

ATB具有高病死率、高传染性,也是我国重点防控的慢性传染病[10]。确诊ATB后给予及时、规律的抗结核治疗,多数患者可取得较好预后,若治疗不合理或不及时,将加重病情,造成永久性肺损伤,甚至引起其他脏器损伤[11-12]。肺结核发生、发展离不开炎症因子,MTB入侵人体后,机体将启动免疫反应,激活免疫细胞,同时IFN-γ、IL-12等大量分泌,并导致CRP、ESR升高参与病情进展。本研究发现,ATB组CRP、ESR、IFN-γ、IL-12水平明显升高,表明ATB患者机体免疫炎症反应紊乱。本研究中162例ATB患者抗结核治疗6个月预后不良发生率为25.93%,与侯学静等[3]报道26.88%相近,说明ATB患者抗结核治疗预后不良风险较高,需引起重视。故探究ATB抗结核治疗预后相关指标,有助于制定个体化治疗方案、促进疾病转归。

miRNA通过与特定的mRNA结合并调控其翻译,参与细胞活动、抗病毒防御及免疫反应,并可介导宿主对MTB的反应[13]。值得注意的是,miR-451a是miRNA家族一员,近期研究显示,miR-451a在肺结核患者中表达降低,能较好地区分ATB与潜伏性结核感染[14]。相关研究亦证实,miR-451a在肺结核患者外周血中呈现低表达[5]。本研究中,ATB患者血清miR-451a水平较NATB患者及对照组明显降低,与既往研究一致。据报道,类风湿性关节炎、小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎、2型糖尿病均与免疫紊乱有关,在这类疾病中均观察到miR-451a异常表达,并认为miR-451a是调节免疫系统异常的重要生物标志物[15]。Li等[16]研究显示,miR-451a通过靶向MIF抑制炎症,并促进M1巨噬细胞向M2巨噬细胞极化,参与机体免疫调节。本研究相关性分析发现,miR-451a与CRP、ESR、IFN-γ、IL-12呈负相关,表明miR-451a水平变化与ATB患者炎症状态关系密切,推测miR-451a通过靶向巨噬细胞表面抗原,调控炎症信号通路,进而参与ATB免疫炎症反应。朱江等[17]研究显示,miR-451a与HBV-ACLF患者预后密切相关,并认为miR-451a可作为该病预后评估指标。本研究发现预后不良者血清miR-451a水平低于预后良好者,且miR-451a是ATB患者预后不良影响因素,表明血清miR-451a水平与ATB抗结核治疗效果密切相关,miR-451a水平降低,预后较差,检测miR-451a水平变化有助于评估预后。结合本研究结果推测,低水平miR-451a对下游炎症通路抑制作用减弱,导致相关炎症反应因子水平增加,加重机体肺部炎症,促使肺损伤加重,从而使患者预后较差。

Toll样受体(TLRs)是模式识别受体的重要亚群,主要存在于肺泡巨噬细胞等抗原呈递细胞上,在宿主免疫细胞对MTB的先天识别中起着关键作用,TLR2、TLR4、TLR9均参与MTB杀灭过程[6]。其中,TLR4位于人染色体9q32-33,集中分布于免疫细胞表面,是首个被发现的TLRs家族成员,当感知到MTB入侵时,通过与核因子-κB(NF-κB)结合激活NF-κB信号途径,或通过MyD88依赖性途径,调节相关蛋白表达,形成免疫抑制微环境,抑制MTB感染[6]。此外,TLR4基因多态性可导致巨噬细胞对细菌成分的反应降低,导致结核病的易感性增加[18]。本研究结果显示,ATB患者血清TLR4水平升高,且ATB患者TLR4与miR-451a呈负相关,与曹建等[7]研究结果相似,表明miR-451a、TLR4与ATB发病过程密切相关,推测miR-451a靶向调控TLR4水平,进而通过NF-κB信号途径或MyD88依赖性途径,调控MTB抗感染过程。进一步分析TLR4与炎症因子相关性,结果显示TLR4与CRP、ESR、IFN-γ、IL-12呈正相关,表明TLR4与结核发病过程中免疫炎症反应紊乱有关,推测TLR4水平升高将加重肺部炎症。徐红波等[19]研究证实,临床预后好转者TLR4水平低于未好转者,且其是肺结核患者预后不良危险因素。本研究同样发现,ATB治疗后预后不良者TLR4水平较高,且TLR4是ATB患者预后不良危险因素,表明检测TLR4水平变化可为临床提供预警作用。推测高水平TLR4将增加炎症因子分泌,促进炎症反应加重,加重肺损伤,因而不利于预后转归。另有研究显示,外周血TLR4可用于诊断脊柱结核,并对脊柱结核复发有较好预测效能[20]。此外,miRNA在MTB感染中发挥重要作用,血清miRNA检测方法简便,且较稳定,是结核病的候选标志物,其中miR-378已被初步确定为结核患者血清中特异性miRNA之一[21]。因此,检测血清miR-451a、TLR4 mRNA水平变化对预测ATB患者抗结核疗效有重要参考价值。ROC曲线显示,miR-451a联合TLR4 mRNA检测的AUC与准确度均高于单一指标检测,且敏感度、特异度均与单独检测时接近,表明二者联合检测时对ATB患者预后有较高预测价值,有助于早期预测预后以指导临床工作。

综上所述,ATB患者血清miR-451a水平降低、TLR4 mRNA水平升高,二者呈负相关,并与炎症因子及预后密切相关,miR-451a联合TLR4 mRNA对预后预测价值较高,能为临床预测ATB患者预后提供参考。但本研究未探讨miR-451a、TLR4 mRNA参与ATB的具体调控机制,有待后续通过基础研究进一步明确。

利益相关声明:论文所有作者共同认可论文无利益冲突。

作者贡献说明:赵勇提出课题及设计实验,参与实施研究,论文撰写;梁丽丽研究指导,对论文进行审阅;江南采集数据及分析数据,参与统计分析。