烤烟褪色前后主要化学成分的变化特征及规律

肖友萍，钟 帅，金保锋，梁耀星，冯玉龙，郭俊杰，王文辉，蔡一霞，王 维*

1.华南农业大学农学院，广州市天河区五山路483 号 510642 2.广东中烟工业有限责任公司，广州市天河区林和西横路188 号 510500 3.广东烟草梅州市有限公司，广东省梅州市梅江区全燕大道118 号 514011

近些年，广东、广西和福建等烟区的初烤烟叶在存放过程中的褪色现象时有发生，原烟褪色的主要原因是烟叶中类胡萝卜素的降解，褪色烟叶在外观上表现为银灰、发白［1］，原烟的外观特征是烟叶收购、调拨等环节中质量判定的重要依据［2］，而褪色原烟在颜色上的变化将直接影响原烟的外观特征，导致原烟外观质量下滑及收购等级降低，进而降低原烟的工业可用性和经济价值。类胡萝卜素是原烟桔黄颜色特征得以体现的基本物质［3-5］，邵兰军等［6］研究发现在高温和潮湿环境下原烟中类胡萝卜素保存率降低，导致原烟颜色发生明显变化。

原烟的褪色程度可以通过L*、a*和b*颜色指标进行表征［7-8］。刘高［9］研究发现，原烟的L*、a*和b*值均与类胡萝卜素的质量分数显著正相关，与褪色程度负相关。贺帆等［10］研究发现烟叶在烘烤过程中的颜色参数色差值的变化与烟叶化学成分具有一定的关联性。柳均等［11］研究表明，原烟还原糖和总酚的质量分数与颜色参数a*值显著负相关，与b*值显著正相关。但目前关于原烟褪色对主要化学成分影响的报道较少，且较少涉及不同品种原烟之间抗褪色能力的比较。为此，本研究中分析了不同品种C3F 和B2F等级原烟褪色前后的颜色参数和主要化学成分的差异，并建立正交偏最小二乘回归（Orthogonal partial least squares，OPLS）模型，以明确原烟主要化学成分与其颜色参数之间的量化关系，并比较不同品种原烟的抗褪色能力，旨在为烟叶生产上选择抗褪色烤烟品种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

供试材料为2021 年产云烟87、粤烟1 号、HB030、湘烟7 号和NX212 品种的C3F 和B2F 等级的烟叶，产地为广东省梅州市五华县。

乙醇（95%，天津市富宇精细化工有限公司）；甲醇溶液（70%，天津市四友精细化学品有限公司）；H3PO4溶液（0.1 mol/L，上海穗试化工科技有限公司）；3,5-二硝基水杨酸（上海麦克林生化科技有限公司）。

WG-01恒温恒湿箱（湖北恒丰医疗制药设备有限公司）；Multiskan FC 酶标仪［赛默飞世尔科技（中国）有限公司］；LC-20A 高效液相色谱仪（上海纳锘实业有限公司）；CR-10 色差仪（柯尼卡美能达控股公司）；HZK-FA210S电子天平（感量0.000 1 g，福州华志科学仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

田间试验于2021 年在广东省梅州市五华县进行，选择土地平整的田块进行试验，前茬作物为水稻，土壤碱解氮为150.02 mg/kg，速效磷为4.45 mg/kg，速效钾为129.88 mg/kg。试验品种（品系）为云烟87、粤烟1 号、HB030、湘烟7 号和NX212，其中，云烟87为当地主栽品种。田间试验采用随机区组设计，设置3次重复，生产管理措施保持一致。每个品种均选取C3F 和B2F 等级（样品等级均由专业分级人员按照GB/T 2635—1992［12］中的方法进行判定）的烟叶样品进行人工褪色试验，各品种均选取10片烟叶单张平铺在恒温恒湿箱中［光强100～120 μmol/（m2·s）、温度25 ℃、相对湿度60%］，进行15 d褪色试验。

1.2.2 指标测定

1.2.2.1 化学成分的测定

总糖和还原糖的质量分数采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定［13］；总氮和烟碱的质量分数分别按照YC/T 33—1996［14］和YC/T 34—1996［15］中的方法测定。

将新鲜烟叶或烤后烟叶剪碎并称取0.200 0 g，置于试管中，加入95%乙醇溶液至20 mL刻度线，封口后避光提取24 h，直至组织变白。采用比色法分别在665、649、470 nm 波长下测定吸光度。依据下列公式分别计算叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的质量分数［9］：

式中：Ca为叶绿素a的质量分数，mg/g；Cb为叶绿素b的质量分数，mg/g；Ck为类胡萝卜素的质量分数，mg/g；D665、D649、D470分别为665、649、470 nm波长下的吸光度。

按照张启发等［16］优化的HPLC 法测定原烟中多酚类化合物的质量分数，色谱柱为Agilent TC-C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

原烟中有机酸类物质质量分数的测定参考易娇等［17］建立的方法，并进行了优化。优化后的分析条件：

色谱柱：Ultimate AQ-C1反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：25 ℃；检测波长：210 nm；进样量：20 μL；流速：1 mL/min；流动相A：0.03 mol/L NaH2PO4溶液（pH=3.00）；流动相B：甲醇；梯度洗脱程序：0 min A∶B=100 ∶0，10 min A∶B=99 ∶1，15 min A∶B=98∶2，18 min A∶B=100∶0。

1.2.2.2 颜色参数

使用色差仪测定原烟的CIE L*a*b*值，参照文献［8］中的方法设置色差仪的主要参数。L*表示亮度值，限值为0～100，0为黑色，100为白色；a*表示红度值，限值为±80，红色为+，绿色为－；b*表示黄度值，限值为±80，黄色为+，蓝色为－［18］。

测量时将原烟平展于实验台上，在每片烟叶主脉左右两侧的叶尖、叶中和叶基部正面分别取点进行测量，为确保所测数据具有代表性，每个品种测量5片烟叶后计算1次平均值，每个品种重复3次。

1.2.3 外观质量评价

由广东中烟工业有限责任公司5名评价人员（行业高级农艺师）对原烟褪色前后各品种的C3F 和B2F等级烟叶进行外观质量评价。

1.2.4 数据处理

利用Excel 2016整理数据，使用SPSS 26对数据进行方差分析，使用Simca 14.1 建立OPLS 模型，并用Origin 2021绘图。

2 结果与分析

2.1 原烟褪色前后色差参数分析

不同品种原烟褪色前后烟叶的照片如图1 所示。可知，经人工褪色（下同）处理后，原烟叶片明显变白，呈银灰色，其中，NX212烟叶的褪色程度较轻，云烟87褪色情况最为严重，即不同品种的原烟褪色程度差异明显。

图1 不同品种原烟褪色前后烟叶的照片Fig.1 Photos of cured tobacco leaves of different varieties before and after color fading

不同品种原烟褪色前后的颜色参数（L*、a*、b*）、色差参数（ΔL*、Δa*、Δb*）及总色差（ΔE）的值如表1所示。可知，不同品种原烟的ΔL*均为负值，说明原烟褪色后其亮度值增大，Δa*、Δb*均为正值，说明原烟褪色后红度值和黄度值均有一定程度的下降。

表1 不同品种原烟褪色前后颜色参数、色差参数及总色差的值①Tab.1 Values of color parameters，color difference parameters and total color difference of cured tobacco leaves of different varieties before and after color fading

对于所有品种的原烟，相比于B2F等级，C3F等级烟叶的总色差值普遍较大，表明C3F 等级烟叶褪色较为严重。不同品种间比较，云烟87的总色差值较大，说明该品种原烟容易褪色；而NX212总色差值较小，表明该品种原烟抗褪色能力较强。

烟叶外观质量评价中颜色、色度指标与原烟颜色密切相关，褪色前后原烟的颜色和色度值变化如表2 所示。可知，不同品种原烟褪色后其颜色值和色度值均有一定程度的下降，其中，云烟87的颜色、色度分值下降最大，而NX212的颜色、色度分值变化最小。结合表1中数据，说明原烟抗褪色能力越强，其原烟外观质量中颜色、色度值下降越少。

表2 不同品种原烟褪色前后外观质量的颜色和色度值变化Tab.2 Variations in color and chromaticity values of cured tobacco leaves of different varieties before and after color fading（分）

2.2 原烟褪色前后化学成分变化分析

2.2.1 常规化学成分变化分析

不同品种原烟褪色前后常规化学成分质量分数的变化情况如表3 所示。可知，所有供试品种原烟褪色后，总糖和总氮的质量分数均下降，而还原糖和烟碱的质量分数均增加，但不同等级烟叶中常规化学成分的变化有所不同。C3F 等级烟叶褪色前后，云烟87 总糖质量分数的变化幅度显著高于其他品种，NX212 还原糖质量分数的变化幅度显著高于其他品种，粤烟1号还原糖质量分数的变化幅度最小，烟碱和总氮质量分数的变化幅度在不同品种间无显著差异。B2F 等级烟叶褪色前后，NX212 总糖质量分数的变化幅度最小，还原糖质量分数的变化幅度较大，与其他4个品种均有显著差异，其中，湘烟7号还原糖质量分数的变化幅度明显低于NX212；烟碱和总氮质量分数的变化幅度在不同品种间无明显差异。整体而言，原烟褪色前后参试品种间总糖和还原糖质量分数的变化程度相对较大，而烟碱和总氮较小。

表3 不同品种原烟褪色前后常规化学成分质量分数的变化①Tab.3 Variations in mass fractions of routine chemical components in cured tobacco leaves of different varieties before and after color fading（%）

2.2.2 多酚类物质变化分析

不同品种C3F和B2F等级原烟褪色前后多酚类物质质量分数的变化如图2和图3所示。可知，烟叶褪色过程中，绿原酸、芸香苷及总酚的质量分数均呈下降趋势。由图2可知，C3F等级中粤烟1号品种在褪色前后绿原酸、芸香苷和总酚的质量分数下降幅度最大，分别为55.57%、40.44%和45.70%，NX212品种在褪色后其绿原酸、芸香苷和总酚的质量分数下降幅度最小，分别为38.09%、30.15%和32.53%，且褪色后NX212 品种中绿原酸、芸香苷和总酚的质量分数均高于其他品种。由图3可知，褪色后B2F等级中粤烟1号中绿原酸、芸香苷和总酚的质量分数下降幅度最大，分别为44.36%、47.66%和41.97%，NX212品种褪色后绿原酸、芸香苷和总酚的质量分数下降最小，分别为36.50%、34.75%和30.96%。综上所述，原烟褪色前后，各品种中多酚类物质的质量分数变化情况存在差异，其中，NX212品种中多酚类物质的质量分数变化幅度最小，可能与其具有较强的抗褪色能力有关。

图2 不同品种C3F等级原烟褪色前后多酚类物质质量分数的变化Fig.2 Variations in mass fractions of polyphenols in cured C3F tobacco leaves of different varieties before and after color fading

图3 不同品种B2F等级原烟褪色前后多酚类物质质量分数的变化Fig.3 Variations in mass fractions of polyphenols in cured B2F tobacco leaves of different varieties before and after color fading

2.2.3 有机酸类物质质量分数变化分析

原烟褪色前后各有机酸类物质的质量分数变化如图4 和图5 所示。可知，所有供试品种原烟褪色后，有机酸类物质的质量分数均有所增加，但C3F和B2F等级原烟中各有机酸类物质质量分数的增幅有所不同。由图4 可知，C3F 等级烟叶褪色后，草酸、苹果酸和柠檬酸的质量分数以及总有机酸质量分数的平均增长幅度分别为9.71%、26.26%、31.10%和24.26%，其中，粤烟1 号褪色后，各有机酸类物质质量分数的增幅均高于平均值，且柠檬酸的质量分数和总有机酸质量分数的增幅最大，分别为41.92%和33.03%；NX212 中除草酸（增幅为20.85%）外，苹果酸、柠檬酸以及总有机酸质量分数的增幅均低于平均值，分别为17.21%、30.56%和18.81%。由图5 可知，B2F 等级烟叶褪色后，草酸、苹果酸和柠檬酸的质量分数以及总有机酸质量分数的平均增幅分别为9.22%、17.42%、20.70%和17.92%，粤烟1 号褪色后各有机酸质量分数的增幅均高于平均值，其中，苹果酸、柠檬酸以及总有机酸的质量分数的增幅最大，分别为33.47%、30.33%和30.45%；NX212 褪色后苹果酸和柠檬酸以及总有机酸的质量分数的增幅在所有品种中最小，分别为6.86%、5.19%和9.07%。由以上分析可知，原烟褪色对各品种不同等级烟叶中有机酸类化合物质量分数的影响具有一定的差异，其中，NX212品种的稳定性最好。

图4 不同品种C3F等级原烟褪色前后有机酸类物质质量分数的变化Fig.4 Variations in mass fractions of organic acids in cured C3F tobacco leaves of different varieties before and after color fading

图5 不同品种B2F等级原烟褪色前后有机酸类物质质量分数的变化Fig.5 Variations in mass fractions of organic acids in cured B2F tobacco leaves of different varieties before and after color fading

2.2.4 类胡萝卜素质量分数变化分析

不同品种原烟褪色前后类胡萝卜素质量分数的变化如图6所示。可知，不同品种原烟C3F和B2F等级烟叶经褪色处理后类胡萝卜素质量分数的降幅均较大，平均降幅分别为74.32%和72.64%。褪色前，NX212 原烟中类胡萝卜素的质量分数最高，湘烟7号中类胡萝卜素的质量分数最低。经褪色处理后，NX212 和HB030 原烟中类胡萝卜素的质量分数较高，云烟87、粤烟1 号和湘烟7 号中类胡萝卜素的质量分数较低，说明不同品种原烟经褪色处理后类胡萝卜素质量分数的变化存在一定差异。其中，NX212 中类胡萝卜素质量分数的降幅最小，且褪色后质量分数较高，这可能与该品种具有较强的抗褪色能力有关。

图6 不同品种原烟褪色前后类胡萝卜素质量分数的变化Fig.6 Variations in mass fraction of carotenoid in cured tobacco leaves of different varieties before and after color fading

2.3 OPLS模型分析原烟褪色程度与化学成分之间的关系

以不同品种原烟化学成分的质量分数作为自变量（X），L*、a*和b*的值作为因变量（Y），建立OPLS 模型，该模型中自变量的R2为0.911，因变量的R2为0.843，说明所建模型分别解释了X 变量和Y 变量中91.1%和84.3%的信息量（置信区间95%）。初烤烟叶与褪色烟叶中不同化学成分的OPLS 模型如图7 所示。根据特征值大于1的原则，化学成分（总糖、还原糖、烟碱、总氮、绿原酸、芸香苷、总酚、草酸、苹果酸、柠檬酸、总有机酸和类胡萝卜素）中提取到2个主成分［t1（38.6%）表示对自变量提取的第1 个主成分，t2（16.3%）表示对自变量提取的第2 个主成分］，这2个主成分的累计贡献率达0.549（>0.5），可以解释大部分原始变量的基本信息。

图7 初烤烟叶与褪色烟叶中不同化学成分的OPLS模型Fig.7 OPLS models for different chemical components in cured tobacco leaves before and after color fading

通过OPLS 模型建立得到的主成分的载荷图如图8 所示［t1（38.6%）表示对自变量提取的第1 个主成分，u1（35.2%）表示对因变量提取的第1 个主成分，下同］。根据X 变量和Y 变量在t1方向上的投影可知，总糖、总氮、类胡萝卜素、芸香苷和绿原酸与L*、a*、b*指标存在较强的正相关关系，还原糖、烟碱、草酸、苹果酸和柠檬酸与L*、a*、b*指标存在一定的负相关关系。

图8 OPLS模型主成分载荷图Fig.8 Principal component load diagram of OPLS model

为进一步明确初烤烟叶与褪色烟叶的化学成分与L*、a*、b*指标间的量化关系，对数据进行OPLS 回归分析。不同品种原烟化学成分的质量分数（X 变量）与L*、a*、b*指标（Y 变量）的主成分拟合方程的R2为0.759，说明X 变量与Y 变量之间存在较强的线性关系，回归方程为：

Y=0.30X绿原酸+0.27X总氮+0.25X类胡萝卜素+0.10X芸香苷-0.05X还原糖-0.05X烟碱+0.03X总糖-0.04X柠檬酸-0.10X草酸-0.14X苹果酸

该回归方程中，绿原酸、总氮、类胡萝卜素、芸香苷和总糖的回归系数均为正值，说明其质量分数与L*、a*、b*指标正相关，上述化学指标的质量分数有所降低；还原糖、烟碱、柠檬酸、草酸和苹果酸的回归系数均为负值，说明其质量分数与L*、a*、b*指标负相关，上述化学指标的质量分数有所升高。

将不同品种原烟褪色前后化学成分的质量分数带入回归方程可以得出对应的ΔY 值，结果如表4 所示。可知，NX212 品种的C3F 和B2F 等级原烟抗褪色能力最强，其次是湘烟7号和HB030，云烟87和粤烟1号品种不同等级原烟的抗褪色能力有所差异，但在所有供试品种中均表现较差。

表4 不同品种原烟的抗褪色能力排序Tab.4 Orders of cured tobacco leaves of different varieties ranked by color fade resistance

3 讨论与分析

（1）原烟褪色后其颜色参数L*、a*、b*的值均有所下降，外观上表现为色泽暗淡，红度值和黄度值下降。由各品种原烟的总色差变化幅度可知，NX212品种原烟的C3F和B2F等级烟叶褪色前后的总色差最小，说明其抗褪色能力较强；对于所有品种的原烟，C3F 等级烟叶的褪色程度均高于B2F 等级。不同品种和不同等级的原烟褪色前后各化学成分的质量分数变化幅度有所差异，这可能与颜色变化的酶促棕色化反应及美拉德反应等化学变化有关［19-21］。

（2）褪色后原烟的总糖、总氮、总酚、绿原酸、芸香苷和类胡萝卜素的质量分数均显著下降，而还原糖、烟碱、草酸、苹果酸、柠檬酸和总有机酸的质量分数均有所上升。褪色后烟叶中总糖和总氮质量分数的下降可能与美拉德反应和氨类物质逸散有关［22］。刘高［9］在研究存放时间对原烟化学成分的影响时发现，原烟总氮和烟碱的质量分数与存放时间呈负相关关系，这与本研究中原烟褪色后烟碱质量分数上升有所差异，原因可能是不同品种的原烟表面菌群组成有较大差异［23］，导致微生物分解碳水化合物、含氮物质等的速率不一样。总酚、绿原酸、芸香苷质量分数的减少可能是原烟在褪色过程中，酚类化合物的酶促棕色化反应过程激烈，程度较深，相关化学成分消耗过度有关，而且过度消耗这些物质会使烟叶内在品质变差，还会对烟叶外观质量造成一定的影响［23］。有机酸质量分数上升可能与原烟中一些物质被氧化成有机酸有关［22］。类胡萝卜素质量分数下降的原因是烟叶经调制后类胡萝卜素从原有组织中游离出来，容易受热和氧等因素的影响而降解［24］，从而导致原烟黄度值下降。值得注意的是，NX212 原烟在褪色后总酚、绿原酸、芸香苷和类胡萝卜素的降幅普遍较小，可能与其不易褪色的特性有关。

（3）本研究中通过构建OPLS回归模型进一步分析了烟叶褪色程度与其主要化学成分的内在联系。通过分析可知总糖、总氮、类胡萝卜素、绿原酸和芸香苷与L*、a*、b*值呈正相关关系，因此，上述指标在原烟褪色后质量分数降低；还原糖、烟碱、草酸、苹果酸和柠檬酸则表现为负相关，这些指标在原烟褪色后质量分数上升。

本研究可为筛选耐褪色烤烟品种提供参考。

4 结论

（1）原烟褪色后其颜色参数L*、a*、b*的值均有所下降，总糖、总氮、总酚、绿原酸、芸香苷和类胡萝卜素的质量分数均显著下降，而还原糖、烟碱、草酸、苹果酸、柠檬酸和总有机酸的质量分数均有所上升。

（2）OPLS 模型分析结果表明，总糖、总氮、类胡萝卜素、绿原酸和芸香苷与L*、a*、b*的值呈正相关关系，还原糖、烟碱、草酸、苹果酸和柠檬酸与其呈负相关关系。

（3）NX212各等级原烟褪色前后的总色差最小，褪色后总酚、绿原酸、芸香苷、苹果酸、柠檬酸、总有机酸和类胡萝卜素的降幅均最小，其抗褪色能力较强，不易褪色。