不同采烤方式上部烟叶外观质量及抗氧化特性分析

刘峰峰，孟 霖，何结望，周迎辉，石 刚，彭五星，乾 艳，杨秀军*，孙福山

1.湖北中烟工业有限责任公司，武汉市东西湖区海口二路2 号 430062 2.中国农业科学院烟草研究所，山东省青岛市崂山区科苑经四路11 号 266000 3.湖北省烟草公司恩施州公司，湖北省恩施州宣恩县建设路36 号 445500

目前，我国上部烟叶存在色深僵厚、化学成分不协调、工业可用性较低等问题。已有研究发现，带茎采烤上部烟叶外观颜色浅橘黄、成熟度高、结构疏松、身份适中、色度鲜亮，常规化学成分协调，感官质量好，可用性高［1-4］。烟叶烘烤过程实质上是采收后的烟叶离开烟株母体处于饥饿代谢状态［5］，在烤房中通过调控环境温湿度等手段，促使烟叶外观变黄失水，烟叶内部发生必要的生理生化变化，进而逐步实现烟叶干制的过程。在此过程中，烟叶代谢活动的能量主要来源于呼吸作用。而带茎采烤上部烟叶时，茎秆中的水分和无机盐离子等可向烟叶中移动，使之处于一种半饥饿代谢状态。带茎采烤上部烟叶品质形成机理与常规逐叶采烤烟叶存在一定差异。余金恒等［6］研究发现，在定色前期及其后的烘烤阶段，带茎采烤上部烟叶的淀粉酶、转化酶活性高于常规采烤和一次逐叶采烤的烟叶，有利于烟叶中大分子物质向小分子物质的转化，以及烟叶化学成分比例的协调。马留军等［7］研究认为，带茎采烤上部烟叶在烘烤过程中失水较难，但色素降解速率高于常规逐叶采烤烟叶；王晓宾等［8］研究表明，带茎采烤上部烟叶总氮含量变化不大，硝酸盐和亚硝酸含量呈先升高后下降的趋势，钾含量比逐叶采烤烟叶稍有增加；魏硕等［9］、滕永忠等［10］、蒋博文等［11］研究均证实了带茎采烤上部烟叶茎秆中水分存在经叶脉向叶片中转移的现象。目前，带茎采烤对上部烟叶烘烤过程生理生化特性的影响研究多集中在水分迁移、色素含量、主要化学成分含量、烤后烟叶质量及效益等方面，而有关抗氧化生理生化方面的研究却鲜见报道。为此，分析了带茎采烤上部烟叶外观质量特点、图像特征以及烘烤过程中烟叶组织结构、活性氧、抗氧化关键酶活性等的变化，旨在为提高上部烟叶可用性提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021年度在湖北省恩施土家族苗族自治州宣恩县椒园烟站进行。供试品种为云烟87，选取标准化生产烟田的烤烟上部5片烟叶（从上至下数），待烟叶充分成熟时采收，采用气流上升式密集烤房烘烤，以上部烟叶第3叶位为研究材料。

1.2 试验设计

设置两个处理，①带茎采烤：采收时上部5 片烟叶连同茎秆一起砍下，挂在烟竿上，每竿30株；②逐叶采烤：作为对照，依次采收上部5片烟叶，按叶位标记编竿，每竿150片。

每个处理3竿，重复3次，均装在密集烤房2层，并设置取样窗。按当地推荐的密集烘烤工艺进行烘烤，在鲜烟叶和烘烤阶段干球温度关键稳温点末（即变黄阶段的38 ℃末、40 ℃末、42 ℃末，定色阶段的46 ℃末、50 ℃末、54 ℃末，干筋阶段的68 ℃末），每个处理取上部烟第3叶位的烟叶9片，在烤房内将叶片去除主脉后置于离心管内，并迅速放入液氮中保存，用于烟叶组织结构观察和相关酶活性（50 ℃以上烟叶细胞已消融，呼吸代谢停止，未检测酶活性）测定。烤后每个处理每次重复分别取上部烟第3叶位的烟叶10 片，进行外观质量评价和颜色亮度值（L*）、红绿值（a*）、黄蓝值（b*）测定。

1.3 测定项目与方法

1.3.1 外观质量评价

由中国农业科学院烟草研究所5 名烟叶分级高级技师以上专家，对烟叶外观质量颜色、成熟度、结构、身份、油分、色度6个因素的评价档次进行赋分，见表1。

表1 烤后烟叶外观质量指标的评价赋分Tab.1 Appearance quality scoring criteria of cured tobacco leaves

1.3.2 烟叶颜色特征值测定

采用相机尼康D6500［尼康光学仪器（中国）有限公司］拍照烟叶正面，在暗箱中标准光源下，成像高度100 cm，采用Matlab 2019进行图像处理，计算提取烟叶的黄色面积百分比，L*、a*和b*值。其中，L*越大亮度越高；a*从负数变为正数，对应颜色从绿色变为红色，b*从负数变为正数，对应颜色从蓝色变为黄色。

1.3.3 组织结构

在各关键温度点分别取两处理上部烟叶第3 叶位各1 片，取叶片中部主脉两侧5 cm 对称0.5 cm×0.5 cm 正方形小块，立即置于FAA 固定液中固定24 h，采用番红-固绿染色制作常规石蜡切片，具体操作参考文献［12］进行。

1.3.4 酶活性与相关物质测定

采用微量法用酶活性专用试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）测定酶活性及相关物质含量（质量分数）。从超低温冰箱（-80 ℃）取出整片烟叶样品，置于低温研磨机中磨粉，根据说明书进行测定。采用NBT 法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性［13］；采用愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性［13］；采用紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽还原酶（GR）活性和丙二醛（MDA）含量［14］；采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定膜脂过氧化物（LPO）含量［15］；采用邻苯三酚法测定超氧阴离子（O2-·）产生速率［14］；采用间苯二酚（PAR）比色法测定过氧化氢（H2O2）含量［15］；采用FRAP 法测定总抗氧化能力（T-AOC）［16］。

1.3.5 数据处理

采用SAS 9.4软件进行单因素方差分析，采用新复极差法（SSR）进行差异显著性检验。采用Excel 2020软件制图。

2 结果与分析

2.1 不同采烤方式烤后上部烟叶外观质量与图像特征比较

由表2可知，两种采烤方式外观质量总分存在显著差异，带茎采烤的烤后烟叶外观质量总分为8.13分，显著高于逐叶采烤烟叶，主要表现在烟叶颜色、结构和身份得分较高。其中，结构和身份得分差异达到显著水平。

表3 表明，与逐叶采烤相比，带茎采烤烟叶黄色面积百分比、L*值和b*值均较高，说明带茎采烤烟叶黄色面积较多、均匀，颜色较鲜亮。而a*值较低，说明带茎采烤烟叶红色较少。

表3 不同采烤方式上部烟叶的颜色特征值Tab.3 Color characteristic values of upper tobacco leaves harvested and cured by different methods

2.2 不同采烤方式上部烟叶烘烤过程中叶片组织结构的变化

由图1 可知，随着烘烤阶段的推进，烟叶组织细胞形态由完整逐渐消融、皱缩，破坏程度逐渐增大，带茎采烤烟叶组织细胞形态消融、皱缩和被破坏程度滞后逐叶采烤的烟叶。

图1 不同采烤方式上部烟叶烘烤过程中烟叶组织结构Fig.1 Microstructure of upper tobacco leaves harvested and cured by different methods during curing progress

在变黄阶段干球温度关键稳温点38 ℃末，两处理烟叶组织细胞排列及形态基本无差异；在变黄阶段40 ℃末，两处理烟叶栅栏组织和海绵组织均出现略微的皱缩，开始出现差异。带茎采烤烟叶细胞液未渗出，而逐叶采烤烟叶则开始出现细胞液外渗，说明变黄阶段40 ℃末带茎采烤烟叶细胞膜结构仍保持完整，而逐叶采烤的细胞膜开始被破坏。在变黄阶段42 ℃末，带茎采烤烟叶组织细胞液开始出现外渗，而逐叶采烤烟叶组织细胞膜明显破损，细胞液明显渗外。

在定色阶段干球温度关键稳温点46 ℃末，带茎采烤烟叶组织细胞膜结构出现破损，但仍具备细胞形态，而逐叶采烤烟叶部分组织细胞形态开始瓦解，出现多个细胞粘连，细胞边界不清晰；在定色阶段50 ℃末，带茎采烤烟叶组织细胞出现消融，部分不完整，逐叶采烤烟叶组织细胞结构皱缩，无法分辨，此时烟叶组织细胞遭到破坏，说明叶片失去生理活性。定色阶段54 ℃末，带茎采烤烟叶组织明显皱缩，细胞消融较明显，仍可观察到细胞核及部分细胞器，逐叶采烤烟叶组织明显皱缩，细胞消融明显，无法观察到细胞器结构。

在干筋阶段干球温度关键稳温点68 ℃末，带茎采烤烟叶组织细胞多皱缩在一起，但仍能观察到组织细胞排列状态，而逐叶采烤烟叶组织细胞则散乱分布。

总体而言，烘烤过程中叶片组织细胞呈现出逐步消融、皱缩、失活、干燥，在定色阶段50 ℃末时烟叶组织细胞失去完整性和生理活性，而带茎采烤烟叶组织细胞完整性较好，消融破坏程度相对滞后。

2.3 不同采烤方式上部烟叶烘烤过程中细胞膜脂质过氧化物和活性氧（ROS）的变化

图2 显示，随着烘烤阶段的推进，烟叶细胞膜脂质过氧化物（LPO）、丙二醛（MDA）含量总体均呈现升高趋势，在关键稳温点定色阶段46 ℃末均达到最高。但两种采烤方式存在一定差异。在烘烤干球温度关键稳温点，与逐叶采烤相比，在变黄阶段38 ℃末时，带茎采烤烟叶LPO、MDA含量均较高，在变黄阶段40 ℃末、变黄阶段42 ℃末、定色阶段46 ℃末时均显著较低，且在转入定色阶段关键稳温点46 ℃末时，带茎采烤的LPO 和MDA 含量分别降低21.02%和32.01%。说明在烘烤中带茎采烤烟叶细胞膜脂过氧化水平较低，有利于较长时间地维持细胞完整性。

图2 不同采烤方式上部烟叶烘烤过程中LPO、MDA和ROS的变化Fig.2 Variations of LPO，MDA and ROS of upper tobacco leaves harvested and cured by different methods during curing progress

H2O2和超O2-·是活性氧的重要组成，随着烘烤进程的推进，烟叶H2O2含量、O2-·产生速率总体均呈逐渐升高趋势。与逐叶采烤相比，在变黄阶段关键稳温点38 ℃末、40 ℃末、42 ℃末时，带茎采烤烟叶H2O2含量和O2-·产生速率均较低，且除在变黄阶段38 ℃末时O2-·产生速率差异不显著，其他差异均达到显著水平，这与上述膜脂质过氧化物含量的动态变化一致；而在转入定色阶段关键稳温点46 ℃末时，带茎采烤烟叶H2O2含量和O2-·产生速率均显著提高，分别提高28.77%和40.26%。这一发现与MDA和LPO 含量变化趋势相反，说明转入定色阶段后带茎采烤烟叶清除活性氧能力减弱或滞后，造成活性氧的积累。

2.4 不同采烤方式上部烟叶烘烤过程中抗氧化酶活性的变化

图3 所示，随着烘烤阶段的推进，两处理烟叶SOD 活性变化规律整体表现不同。其中，带茎采烤的呈先下降再上升又快速下降的趋势，而逐叶采烤的则一直呈下降趋势，两处理在转入定色阶段关键稳温点46 ℃末时降低到同一水平。在变黄阶段关键稳温点除38 ℃末时，带茎采烤烟叶SOD活性显著低于逐叶采烤的，变黄阶段40 ℃末和42 ℃末时，带茎采烤烟叶SOD 活性均显著高于逐叶采烤的，分别提高32.54%和46.61%。

图3 不同采烤方式上部烟叶烘烤过程中抗氧化酶活性的变化Fig.3 Variations of antioxidant enzyme activities of upper tobacco leaves harvested and cured by different methods during curing progress

两处理烟叶CAT活性总体呈现先升高再降低的变化趋势。带茎采烤烟叶在变黄阶段关键稳温点40 ℃末时达到高峰，为382.90 U/g，且比逐叶采烤提高27.82%；逐叶采烤的在变黄阶段42 ℃末时达到高峰，为373.46 U/g，且显著高出带茎采烤17.27%，在定色阶段关键稳温点46 ℃末时达到最低，且显著低于带茎采烤26.63%。

随着烘烤阶段的推进，带茎采烤烟叶GR 活性呈现逐步升高又降低趋势，在变黄阶段关键稳温点42 ℃末时达到高峰，而逐叶采烤的GR 活性呈慢-快-慢升高趋势，在定色阶段关键稳温点46 ℃末时达到最高。在变黄阶段关键稳温点38 ℃末、40 ℃末、42 ℃末时，带茎采烤烟叶GR 活性均显著高于逐叶采烤烟叶，在转入定色阶段关键稳温点46 ℃末时，低于逐叶采烤45.49%，此时两处理差异最大。这一变化趋势与H2O2含量和O2-·产生速率恰好相反，意味着GR 可能在H2O2和O2-·的清除中发挥关键作用。

随着烘烤阶段的推进，两处理烟叶T-AOC 总体呈逐步上升趋势。与逐叶采烤相比，带茎采烤烟叶抗氧化酶活性总体较高，且在烘烤关键稳温点变黄阶段40 ℃末、定色阶段46 ℃末差异达到显著水平，说明带茎采烤烟叶抗氧化能力较强。

3 讨论

烤烟上部烟带茎采烤和逐叶采烤处理烤后烟叶外观质量特征和图像特征分析表明，上部烟带茎采烤烟叶外观质量好于逐叶采烤，带茎采烤烟叶图像特征L*值、b*值均高于逐叶采烤，这与已有研究报道结果一致［4，17-18］。在烟叶烘烤过程中，叶片组织细胞逐步消融、失活和干燥，在定色阶段50 ℃末，带茎采烤烟叶片组织细胞出现消融、部分不完整，这有利于叶片组织细胞完整性保持较长时间，细胞膜结构破坏滞后。这与刘朝营等［19］研究结果基本一致，进一步验证了上部烟带茎采烤中烟叶细胞抗氧化能力较强，有利于保持叶片组织细胞生理活性［9-11］。

植物叶片中参与氧化、抗氧化活动的酶类较多，烟草上SOD、CAT 和GR 3 种抗氧化酶研究较多［20-22］。其中，SOD广泛存在于动物、植物和微生物中，且是体内清除活性氧的第一防线，可催化超氧化物的歧化反应，在逆境胁迫条件下增强植物的耐受能力［23］。本研究中的SOD 活性变化趋势与Siddiqui等［24］对大豆高温胁迫下的研究结果一致，在大豆中研究发现轻度高温胁迫下叶片SOD 活性增强，但不同品种对胁迫的响应不一致。持续高温下SOD出现持续下降的现象，原因在于高温破坏了SOD 的构象。在干旱、光照、重金属及高渗透压等逆境条件下，植物体内CAT 的表达量及活性都有所提高［25］，说明CAT在植物抗逆方面发挥着重要作用。而烟叶烘烤也是在人为提供较高温度的胁迫条件下进行的，本研究中带茎采烤烟叶3种抗氧化酶活性在变黄阶段总体高于逐叶采烤且差异达到显著水平。MDA是一类重要的LPO，其含量常被用来评价细胞的消融破裂程度［26］。本研究中发现带茎采烤烟叶MDA 和LPO 含量始终低于逐叶采烤，H2O2和O2-·两种重要的活性氧成分含量和产生速率与膜脂过氧化状态密切相关，高浓度的活性氧会导致细胞膜过氧化，促进MDA 的积累，过高会导致细胞死亡［27］。本研究中还发现带茎采烤定色阶段46 ℃末H2O2含量和O2-·产生速率均高于逐叶采烤，且GR 活性高低变化趋势与H2O2含量、O2-·产生速率相反，说明GR 是影响H2O2和O2-·清除的关键酶之一，深入研究烟叶烘烤中活性氧和酶活性有利于探明烟叶烘烤中品质形成的代谢生理基础。

4 结论

上部烟带茎采烤和逐叶采烤烟叶外观质量以及烘烤中叶组织细胞结构和抗氧化能力存在差异。与逐叶采烤相比，带茎采烤烟叶外观质量较好，颜色黄色面积、L*值和b*值较高；在烘烤过程中烟叶细胞结构完整性维持时间较长。在变黄阶段烟叶抗氧化酶活性较高，活性氧清除能力较强，细胞过氧化程度较低，有利于保持烟叶细胞生理活性，促进物质转化，烟叶颜色变浅，上部烟叶的可用性得到改善。