3D打印含镁聚己内酯支架修复大鼠颅骨缺损

李筱叶， 李强， 戴卓， 丁梦， 董衡， 董强生， 白晶， 牟永斌

1.南京大学医学院附属口腔医院，江苏 南京（210008）； 2.东南大学材料科学与工程学院，江苏 南京（211189）

颌面部骨缺损是指由感染、创伤，肿瘤、手术以及部分先天性疾病引起的骨质局部缺失，其在一定程度上限制了口腔种植手术的应用，因此如何更好地修复骨缺损引起了许多学者的关注［1-2］。基于支架的骨组织工程（bone tissue engineering，BTE）是促进骨再生修复的方法之一［3］。相对于自体骨移植、同种异体骨移植和异种骨移植，其优势在于规避了免疫排斥、感染、移植骨供应有限等不足［4-5］。BTE 支架是一种能在骨缺损部位为骨再生提供特定环境和三维空间、促进骨组织向内生长的生物材料。通过改善其几何形态、机械性能和生物学活性可以增强其骨修复效果。

聚己内酯（polycaprolactone，PCL）是一种具有良好生物相容性的聚合物材料，其具备优异的生物降解性和可修饰性能，已被FDA 批准应用于临床试验［6-8］。相对于天然聚合物，如胶原、壳聚糖、海藻酸盐等，合成聚合物是经过严格设计且可大规模合成的［9-10］。值得关注的是，PCL 由于其较低的熔点表现出极大的设计灵活性，辅以三维打印（3D print），可以定制具有个性化形状和孔径/孔隙率的PCL 支架［11］。然而，与天然聚合物相比，PCL支架与细胞间的相互作用能力较弱，不具备骨诱导功能［12］。镁（magnesium，Mg）元素天然存在于骨组织中，缺乏Mg 会导致骨骼脆性增加、骨再生延迟、骨密度降低等［13-15］。因此，本课题组试想将Mg作为一种掺杂剂应用在骨组织工程中，其可以高效率地提供Mg 离子，以促进细胞黏附及增殖分化、增强骨再生和钙化。根据本课题组之前的研究［16］，掺杂3 wt% Mg 微粒对比于其他掺杂比例（1 wt%、5 wt%、7 wt%和9 wt%），显示出最高的成骨效率和良好的综合性能。因此，本实验拟构建大鼠颅骨缺损模型，缺损区植入掺杂3 wt% Mg 微粒的3D 打印PCL 基支架，以评估PCL-Mg 支架的骨修复能力，为骨组织工程提供新的潜在材料。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器

PCL（阿拉丁化学试剂公司，美国）；Mg 微粒（唐山伟豪镁粉有限公司，中国）。SD 大鼠由上海市计划生育科学研究所实验动物经营部提供，动物合格证号［SCXK（沪）2018-0006］。3D 打印机（FDM3000，Stratasys，美国）；场发射扫描电子显微镜（Sigma360，Zeiss，德国）；能谱分析仪（Ultra 55，Zeiss，德国）；接触角仪（One Attension，Biolin Scientific，瑞典）；电子万能试验机（CMT4503，美特斯工业系统有限公司，中国）；电感耦合等离子体质谱仪（iCP 6500，Thermo，美国）；micro-CT（Hiscan XM，苏州海斯菲德信息科技有限公司，中国）；CT 三维重建分析（Hiscan Reconstruct/Analyzer software V3.0，苏州海斯菲德信息科技有限公司，中国）。

1.2 3D 支架材料的制备及表征

通过共混合3D 打印制备掺入3wt%镁微粒的PCL 支架［16-17］。首先，加热PCL 至200 ℃并保持15 min，直至达到黏稠流动状态。Mg 微粒以3 wt%加入熔融PCL 中。以50 rpm/min 的速率搅拌熔融的Mg/PCL 混合物160 min，使Mg 微粒在PCL 基质中均匀分布。将凝固后的混合物装入3D 打印机，然后在3D 打印机的挤出腔中熔化，最后以0°/90°沿z 轴逐层打印。3D 打印温度设定为160 ℃，打印机喷嘴移动速度为1.5 mm/s，3D 打印的模型为Ø13 mm × 4.3 mm 圆柱体（用于物理化学表征）或Ø5 mm×1.5 mm 圆柱体（用于动物实验）。

通过扫描电子显微镜观察PCL 及PCL-Mg 支架的微观形貌，并计算孔径、纤维直径和孔隙率。使用能谱分析仪（energy dispersive spectrometer，EDS）对PCL-Mg 支架表面元素进行分析，以验证镁微粒的成功掺入。通过接触角计测量接触角，测试液体为2 μL 蒸馏水，待水滴在支架材料表面稳定后，记录并分析水滴切线与材料水平面夹角。室温下，支架材料使用电子万能试验机以1 mm/min 的压缩速率测试压缩性能。此外，为了揭示Mg 离子的释放行为，将3D 打印的PCL-Mg 支架浸泡在磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer solution，PBS）中，溶液体积与支架表面积之比设定为30 mL/cm2，使用电感耦合等离子体质谱法检测不同时间点PBS 溶液中的Mg2+含量。

1.3 实验分组

15 只SD 大鼠，随机分为3 组，每组5 只：根据植入支架材料不同，分为PCL 组和PCL-Mg 组，未行治疗的作为对照组。本实验已获得南京大学实验动物福利伦理审查委员会批准（批号：IACUC-2003034）。

1.4 大鼠颅骨缺损模型构建

SD 大鼠行异氟烷吸入麻醉，麻醉产生效果后，颅顶区备皮，消毒，铺无菌手术孔巾。沿颅顶做正中矢状全层切口，约15 mm。解剖分离，暴露颅顶区，于颅骨正中缝一侧顶骨区使用取骨环钻，在生理盐水冷却下制备出直径5 mm 圆形颅骨全层缺损，术中避免损伤硬脑膜和矢状窦。分别将各组支架材料植入缺损处，对照组不植入任何材料。最后缝合封闭骨膜和头皮。术后3 d 予以青霉素4 万单位/d，预防感染。

1.5 微型计算机断层扫描（micro-CT）及数据定量分析

每组SD 大鼠吸入麻醉下，于术后4 周、8 周分别行活体micro-CT 扫描，用于定量评估缺损部位新生骨形成。扫描参数为：80 kV，100 μA，单次曝光时间50 ms，扫描分辨率25 μm，扫描角度间隔0.5度，通过软件重建及分析定量颅骨缺损区域的新生骨体积（bone volume，BV）、骨体积分数（bone volume/total volume，BV/TV）、骨表面积（bone surface，BS）、骨表面积组织体积比（bone surface/total volume，BS/TV）、骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）、骨小梁分离度（trabecular separation/spacing，Tb.Sp）、骨小梁数（trabecular number，Tb.N）和骨矿物密度（bone mineral density，BMD）。

1.6 组织学切片及安全性评价

术后8 周，在戊巴比妥麻醉下用颈椎脱位法处死大鼠，获取颅骨术区样本，去除颅内容物及软组织，仅留颅顶骨及植入物，标本经4%多聚甲醛固定，10%乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙2 周。经石蜡包埋，切片，苏木素-伊红（H&E）染色、Goldner 染色或VG 染色，封片，干燥。采用光镜观察新生骨情况。为了研究支架材料的体内安全性，在植入支架8 周后，通过H&E 染色切片对主要的组织器官（心、肝、脾、肺和肾）进行切片观察。

1.7 统计学分析

统计分析使用GraphPad Prism 10.0 软件进行。使用单因素方差分析（ANOVA）评估组间差异，然后使用Tukey 多重比较检验。所有计量资料均用均值±标准差表示，检验水准α=0.05。

2 结 果

2.1 3D 支架材料表征

PCL 支架及PCL-Mg 支架的宏观及微观形貌见图1a，均为多孔结构，孔径为（480 ± 25）μm，纤维直径为（300±25）μm，孔隙率约为66%。EDS 分析结果显示（图1b），PCL-Mg 支架表面可见含Mg 元素的凸起（Mg 含量为1.0 At%），表明成功掺入了Mg 微粒；占75.0 At%的C 元素和23.7 At%的O 元素为PCL 的主要成分。基于水接触角对支架润湿性的评估结果显示（图1c），PCL 的水接触角为97.63°± 2.66°，PCL-Mg 的水接触角为68.97° ± 1.39°，相较于PCL 降低，具有统计学差异（P＜0.001），表明Mg微粒的掺杂增加了材料表面亲水性。机械性能测试结果显示（图1d），PCL-Mg 支架的压缩模量（57.37 ± 8.33）MPa 优 于PCL 支 架（36.27 ± 1.65）MPa，差异具有统计学意义（P= 0.025）。Mg2+的体外释放行为结果显示（图1e），在28 d 中Mg2+被持续释放到浸泡溶液中。

Figure 1 Morphologies and characterization of the PCL and PCL-Mg scaffolds图1 PCL 和PCL-Mg 支架材料的形貌及材料学表征结果

2.2 不同材料支架对大鼠颅骨缺损的修复效果比较

不同材料对颅骨缺损修复的效果见图2，对照组（无植入物）手术后4 周和8 周，骨缺损底部及边缘均未见新增阻射影，表明无明显骨再生现象；PCL 组缺损底部形成少量不规则点状骨，缺损边缘出现少量不规则新生骨，空洞缺损略有缩小，缺损区大部分未修复；PCL-Mg 组中新生骨在手术后4 周即生长到支架中，且在手术8 周后继续增长，在骨缺损上形成较厚的新骨组织层。

Figure 2 Micro-CT reconstructed images of SD rats with skull defects after 4 and 8 weeks of scaffolds implantation surgery图2 SD 大鼠颅骨缺损行支架植入术后4 周及8 周骨缺损区micro-CT 三维重建图像

新生骨定量分析结果见图3，支架植入后4 周，对 照 组、PCL 组 和PCL-Mg 组 的BV/TV 分 别 为7.17% ± 0.44%、7.49% ± 0.67%和10.29 ± 1.28%，BMD 分别为（1 680.91±17.67）mg/cm3、（1 692.67 ±17.5）mg/cm3和（1 715.88±6.48）mg/cm3；8 周后对照组、PCL 组和PCL-Mg 组的BV/TV 分别为7.90% ±0.50%、9.53%±1.12%和13.51%±0.53%，BMD分别为（1 690.66±13.85）mg/cm3、（1 715.65±12.67）mg/cm3和（1 743.55 ± 11.21）mg/cm3，对照组与PCL 组比较BV/TV、BMD的差异无统计学意义（P＞0.05），PCL-Mg组与对照组差异具有统计学意义（BV/TV：4 周：P＜0.001，8 周：P＜0.001；BMD：4 周：P= 0.016，8 周：P＜0.001）。此外，PCL-Mg 组大鼠新生BV、BS、BS/TV、Tb.Th、Tb.N 在4 周和8 周均显著高于其余两组，而Tb.Sp 显著降低。

Figure 3 Quantitative analysis of the new bone in bone defect areas of SD rats after 4 and 8 weeks of scaffolds implantation surgery图3 SD 大鼠颅骨缺损行支架植入术后4 周及8 周后骨缺损区新生骨定量分析

通过H&E 染色、Glodner 染色和VG 染色从组织层面上观察颅骨缺损修复水平，组织形态学染色结果与micro-CT 有相似的趋势（图4）。对照组仅有薄层纤维结缔组织覆盖于骨缺损部位，骨缺损几乎无愈合；PCL 组沿着支架表面形成少量未矿化的骨组织，留有大量未充填的间隙，同时骨缺损区域表面形成了较厚的纤维组织；PCL-Mg 组在支架处形成较厚的矿化新骨，在支架相互连接的孔隙中充满了骨胶原纤维组织，表现出增强的骨再生行为。

Figure 4 Histological staining images of SD rats with skull defects after 8 weeks of scaffolds implantation surgery图4 SD 大鼠颅骨缺损行支架植入术后8 周骨缺损区组织学染色结果

大鼠主要组织器官（心、肝、脾、肺和肾）H&E染色切片如图5 所示，各组大鼠的主要组织器官未见明显差异，无明显炎症或异常破坏。

Figure 5 H&E staining images of major organ sections(heart,liver,spleen,lung,and kidney)of SD rats with skull defects after 8 weeks of scaffolds implantation surgery图5 SD 大鼠颅骨缺损行支架植入术后8 周主要脏器切片（心、肝、脾、肺和肾）的H&E 染色结果

3 讨 论

骨组织工程支架虽然已经从传统细胞种子支架发展到无细胞支架，但这也对其生物活性提出了更高的要求，以募集、诱导和活化内源性细胞解决骨缺损修复的挑战［18-19］，目前已经开发了许多生物材料来制备BTE 支架［20-22］，包括天然或合成聚合物（例如胶原蛋白、纤维蛋白、透明质酸、壳聚糖或聚乳酸、PCL、聚乳酸-羟基乙酸共聚物等）、生物金属（例如钽、钛、铁、镁等）、生物陶瓷（例如羟基磷灰石，磷酸钙、生物活性玻璃等）及生物复合材料（如金属涂覆磷酸钙，羟基磷灰石/壳聚糖凝胶等）。而关于PCL 基支架与可生物降解金属Mg 结合的报道较少。研究表明，Mg 在降解的过程中，释放的Mg2+增强了降钙素基因相关肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）的合成及其在骨膜感觉神经末梢的释放，CGRP可以提高骨膜干细胞（periosteum derived stem cells，PDSCs）的成骨分化能力，是骨缺损愈合过程中Mg2+促进骨再生的主要机制［23-25］。而与其他含Mg 化合物或镁合金相比，纯Mg 微粒的降解速度更快，可以高效提供镁离子［26］。本研究中PCL-Mg 支架孔径约为（480 ± 25）μm，孔隙率约为66%，有研究提出孔径200～600 μm 是确保细胞生长、营养扩散、维持成骨和成血管潜在空间的最佳孔径［14,27］，本研究设计的多孔结构为可以满足细胞迁移和营养交换，并提供必要的机械支撑。此外，适当的金属Mg 掺入增加了粗糙度，改善了其润湿性，其亲水性的增加有利于植入支架上的细胞黏附、增殖和分化［28］。压缩强度的提高表明适当的Mg 掺入有助于机械性能的增强，这可能与颗粒分散或键能增加有关［29-30］，但其具体机制仍然未知。另外，通过与静电纺丝和盐浸等方法制备的含Mg 支架相比，3D 打印制备的PCL-Mg 支架在相同孔隙率的条件下具有更高的压缩模量［31-34］。在本实验中，应用于大鼠颅骨缺损修复的PCL 支架含3 wt%Mg，micro-CT 数据结合组织学切片结果证实了Mg 在骨缺损愈合中的促进作用，相较于PCL 支架，其获得了更多的骨体积以及更优的骨小梁结构，并观察到从术后4～8 周缺损区域内的持续成骨，表明PCL-Mg 组在早期和晚期均能促进骨形成。此外，本实验通过大鼠主要脏器H&E 切片评估支架材料的长期安全性，支架材料及其缓慢释放的Mg2+离子不会造成任何实质性损伤。

综上，本研究通过3D 打印制备了Mg 掺杂的PCL 基支架。PCL-Mg 支架具有良好的生物相容性和增强的成骨活性，这为3D 打印骨组织工程支架材料应用于颌面部骨缺损修复提供了一定依据。

【Author contributions】Li XY performed the experiments and wrote the article.Li Q, Dai Z, Ding M performed the experiments and revised the article.Dong H, Dong QS, Bai J, Mou YB revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.