活性氧响应的纳米颗粒对炎性环境下牙龈成纤维细胞功能的影响及机制

邱心一， 宋璐彤， 任双双， 苗雷英

南京大学医学院附属口腔医院，南京市口腔医院牙体牙髓病科，江苏 南京（210008）

慢性牙周炎是一种由细菌引起的慢性炎症性疾病，是导致牙齿松动脱落的主要原因［1］。研究表明，牙周组织局部的氧化应激环境是导致牙周炎症加重、组织破坏的主要原因［2］。调节局部活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平从而减轻牙周组织炎症、促进组织再生成为治疗牙周炎的新策略［3］，因此，以ROS 为靶点的生物纳米材料研发得到研究人员高度关注［4］。

PssL-NAC（PEG-ss-PCL@NAC）是一种能响应细胞内高水平ROS 并按需释放药物的纳米释药颗粒。针对牙周炎症过程中局部环境中ROS 升高，通过响应ROS 的硫缩酮键（thioketal，TK）连接聚己内酯（polycaprolactone，PCL）的疏水端和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）的亲水端，水相油相自主装的方式得到内部包裹油溶性的抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine-NAC）的PssL-NAC 微球。其中，硫缩酮键具有ROS 响应特性，在炎症环境ROS 高水平下，硫缩酮键断裂，PssL-NAC 微球从疏水蜷缩态转变为舒展态，微球内的NAC 随之释放，实现NAC 在炎症部位的靶向积累。本课题组前期研究已经成功自主合成、表征PssL-NAC 纳米颗粒，证明PssL-NAC 能够响应高水平ROS，通过自激活调节的方式释放包裹在内部的抗氧化剂NAC，通过缓释效果将细胞内ROS 维持在适宜的水平［5］。在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激下维持人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）内两倍对照组水平的ROS，并促进其成骨分化［5］。此外，PssL-NAC 能够通过调节丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和 核 因 子κB（nuclear factor-κB p65，NF-κB）通路关键蛋白的磷酸化从而调节巨噬细胞向抗炎的M2 表型极化［6］。前期的体内实验中发现PssL-NAC 处理后大鼠牙龈纤维较牙周炎大鼠排列更加整齐、致密，然而PssL-NAC 在细胞水平上对牙龈成纤维细胞的影响和其具体机制仍不清楚。因此本研究利用牙龈卟啉单胞菌脂多糖（Porphyromonas gingivalis-lipopolysaccharide，P.g-LPS）刺激人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，HGFs）模拟炎症反应，观察PssL-NAC 在抑制炎症、维持细胞功能中的具体作用及机制，为治疗牙周炎治疗过程中促进软组织再生的策略提供理论依据。

1 材料和方法

本研究经南京大学医学院附属口腔医院医学伦理委员会审查批准（批号：NJSH-2022NL-009）。本研究于2022 年10 月至2023 年7 月在南京大学医学院附属口腔医院中心实验室进行。

1.1 主要试剂和仪器

DMEM（11965118，Gibco，美国），PBS（G4202，赛维尔，中国），胎牛血清（FSS500，依科赛，中国），NAC（616-91-1，Sigma，美国），P.g-LPS（SMB00610，Sigma，美国），CCK8 试剂盒（CK04，同仁，日本），活性氧检测试剂盒（S0033S，碧云天，中国），细胞RNA 提取试剂盒、逆转录试剂盒、RT-qPCR 试剂盒（RC112，R323，Q711，诺维赞，中国），RIPA 裂解液（P0013B，碧云天，中国），DEPC 水（B501005，生工，中国），一抗抗体TLR4（ab13556，Abcam，美国），一抗抗体p65、p-p65，Tublin（AF5006，AF2006，AF7021，Affinity，中国）；二抗山羊抗兔抗体（Ab_2337913，Jackson，美国）；SurePAGE™预制胶，电泳缓冲液（M42012C，M00138，金斯瑞，中国），TBST（C006161，生 工，中 国），PVDF 膜（IPVH00010，Millipore，美国）。

共聚焦显微镜（Nikon Ti A1，Nikon，日本），Nanodrop 核酸蛋白检测仪（One，Thermo，美国），酶标仪（SpectraMAXM3，Thermo，美国），RT-qPCR 仪（ViiA V7Dx，Thermo，美国），化学发光成像仪（Tanon5200，天能，中国）。

1.2 人牙龈成纤维细胞的分离、培养

选取3 例知情同意、既往健康无牙周疾病患者拔除阻生齿时需切除的牙龈组织，放入含20%胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、1%双抗（青霉素+链霉素）的DMEM 培养基中，1 h 内取出牙龈组织，生理盐水反复冲洗，在超净工作台内将牙龈组织修剪为1 mm3的组织块，放入T25 培养瓶中，加入5 mL 含10%FBS、1%双抗的DMEM 培养基，在37 ℃、5% CO2培养箱中倒置培养，4 h 后翻瓶。待细胞在瓶中融合至80%后传代，后续实验使用的细胞为3～6 代。

1.3 PssL-NAC 微球制备和NAC 水溶液制备

将PEG-ss-PCL（PssL）纳米颗粒溶于50 mL 去离子水（deionized water，ddH2O）中，将5 mg NAC 溶于5 mL 二氯甲烷中，使用水相油相自组装的方法，在超声震荡下，用滴管吸取溶有NAC 的二氯甲烷溶液，缓慢滴加到溶有PssL 的30 mL ddH2O 中，迅速搅拌，超声震荡45 min。将获得的分散于水中的PssL-NAC 溶液超声1 h，用滴管将该溶液滴加至铜网上（附有20 nm 厚度的碳支持网），静置干燥后采用JEM-100 透射电镜观察纳米粒子的形貌及粒径。将5 mg NAC 溶于30 mL ddH2O 中，超声下搅拌混匀得到NAC 溶液。

1.4 细胞内ROS 检测

将HGFs 铺于直径为35 mm 玻璃底小皿中，铺板密度为1×105个/孔。待细胞融合至80%后分别加入P.g-LPS（0、5、10 μg/mL），P.g-LPS（0、5、10 μg/mL）+NAC，P.g-LPS（0、5、10 μg/mL）+ PssL-NAC。共培养24 h 后，去除原培养基，按1：1 000 加入2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐（dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）活性氧探针，在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育20 min，去除培养基，磷酸缓冲生理盐水（phosphate buffer saline，PBS）冲洗3 次，共聚焦显微镜观察488 nm 下的细胞荧光强度，确定后续实验使用的P.g-LPS 浓度。

1.5 实验分组

将提取的人牙龈成纤维细胞随机分为空白对照组（不做处理），P.g-LPS 处理细胞为P.g-LPS 组，P.g-LPS+NAC 处理细胞为NAC 组，P.g-LPS+PssLNAC 处理细胞为PssL-NAC 组。NAC 组中，将NAC水溶液按10%（v/v）加入孔板中，使NAC 终浓度为20 μg/mL。PssL-NAC 组中PssL-NAC 的使用浓度为10%（v/v），在该体积比下，PssL-NAC 中NAC 含量与同体积比的20 μg/mL 中NAC 含量一致。

1.6 细胞增殖实验

将HGFs铺于96孔板中，铺板密度为4×103个/孔。待细胞贴壁后分别加入10 μg/mLP.g-LPS；此外，分别加入NAC、PssL-NAC，共培养1、3、5、7 d 后，去除培养基，每孔加入含10% CCK-8 试剂盒工作液的无血清DMEM 培养基，在37 ℃、5%CO2培养箱中孵育1.5 h，酶标仪450 nm 波长下检测OD 值。

1.7 RT-qPCR 检测炎症因子及胶原生成的相关基因表达

将HGFs铺于6孔板中，铺板密度为4×105个/孔。待细胞融合至80%后加入NAC 或PssL-NAC 预处理12 h 后去除原培养基，加入P.g-LPS（10 μg/mL）刺激6 h，PBS 冲洗3 次，加入Trizol 裂解液提取细胞总RNA，Nanodrop 核酸蛋白检测仪检测RNA 浓度，使用逆转录试剂盒转录为cDNA。以GAPDH 为内参，使用RT-qPCR 试剂盒检测炎症因子白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和Ⅰ型胶原蛋白（collagen 1，COL1）、Ⅲ型胶原蛋白（collagen 3，COL3）水平。引物序列表见表1。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences in RT-qPCR

1.8 划痕实验观察各组人牙龈成纤维细胞的迁移能力

将HGFs铺于6孔板中，铺板密度为4×105个/孔。待细胞融合至80%后加入NAC 和PssL-NAC 预处理12 h 后去除原培养基，加入P.g-LPS（10 μg/mL），用移液枪在孔板底部划痕，划痕后0、3、6、12 h 后拍摄照片，并半定量分析划痕距离变化。

1.9 Western blot 测定TLR4-NFκB 通路相关蛋白表达

将HGFs铺于6孔板中，铺板密度为4×105个/孔。待细胞融合至80%后NAC 和PssL-NAC 预处理12 h后去除原培养基，随后加入P.g-LPS（10 μg/mL）共培养30 min，去除原培养基，PBS 冲洗3 次，加入RIPA 裂解液和磷酸酶抑制剂提取细胞总蛋白，Nanodrop 核酸蛋白检测仪检测蛋白浓度。加入1×SDS上样液后95 ℃充分变性。在电泳凝胶均匀加入等量蛋白（40 μg），电泳完成后转移蛋白至PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭1 h。将TLR4、p65、p-p65、内参Tublin 一抗抗体以1∶1 000 比例稀释后均匀覆盖于PVDF膜上，室温下孵育2 h后洗膜3次。将1∶5 000稀释的山羊抗兔二抗抗体于PVDF 膜室温下孵育1 h，曝光观察蛋白表达情况。

1.10 统计学分析

应用SPSS 22.0 软件进行统计学分析，正态分布的计量资料以均数± 标准差表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和双因素方差分析（two-way ANOVA）对各指标进行比较。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 HGFs 细胞原代提取及培养

经组织块培养法培养后，组织块周围可见细胞爬出（图1a）。体外培养的HGFs 细胞为长梭形或星形，细胞形态均一（图1b）。

Figure 1 Isolation and culture of human gingival fibroblasts图1 人牙龈成纤维细胞的分离与培养

2.2 PssL-NAC 纳米颗粒成功合成

采用水相油相自主装合成的PssL-NAC 纳米颗粒，电镜下观察形态规则呈球形，直径约为120 nm（图2）。

Figure 2 TEM images of PssLNAC nanoparticles图2 PssL-NAC 纳米微球透射电镜图

2.3 PssL-NAC 维持P.g-LPS 刺激下的HGFs 细胞内适宜浓度ROS

与对照组（P.g-LPS=0 μg/mL）相比，随着P.g-LPS浓度升高，细胞荧光强度增强，代表细胞内ROS 水平升高（P＜0.001，P＜0.001）。P.g-LPS=5、10 μg/mL时，分别加入NAC 和PssL-NAC 均显著降低了P.g-LPS 诱导的高水平ROS（P＜0.001，P＜0.001）。在P.g-LPS 浓度升高的情况下，NAC 组的细胞内ROS 水平始终与对照组（P.g-LPS=0 μg/mL）无显著差异（P＞0.05）。与对照组（P.g-LPS=0 μg/mL）相比，在P.g-LPS=0、5、10 μg/mL 时，PssL-NAC 组细胞内ROS 水平较高（P=0.005，P=0.004，P=0.002），约为对照组（P.g-LPS=0 μg/mL）的2 倍（图3）。在P.g-LPS=10 μg/mL 时ROS 升高效果最为显著，因此选择P.g-LPS=10 μg/mL 进行后续实验。

Figure 3 Comparison of intracellular reactive oxygen species levels in human gingival fibroblasts with different concentrations of P.gingivalis-lipopolysaccharide图3 不同浓度牙龈卟啉单胞菌脂多糖处理人牙龈成纤维细胞后细胞内活性氧水平比较

2.4 PssL-NAC 对HGFs 细胞增殖无抑制作用

使用10 μg/mL 的P.g-LPS 处理细胞，在共培养5、7 d 后观察到细胞增殖抑制（P= 0.039，P=0.003）。与空白对照组相比，在P.g-LPS 存在的条件下，NAC 处理细胞后，在1、3、5、7 d 细胞增殖均未受到明显抑制（P= 0.981，P= 0.894，P= 0.788，P=0.079），PssL-NAC 处理细胞后，在1、3、5、7 d 细胞增殖也未受到明显抑制（P= 0.998，P= 0.817，P= 0.999，P= 0.576），表明NAC 与PssL-NAC 均无明显细胞毒性。在第7 天时，NAC 和PssL-NAC 能恢复P.g-LPS 抑 制的细胞增殖（P＜0.001，P＜0.001）（图4）。

Figure 4 Cell proliferation ability of human gingival fibroblasts in different treatment groups图4 不同处理组人牙龈成纤维细胞的增殖活性

2.5 PssL-NAC 在P.g-LPS 刺激下降低炎症因子表达，促进胶原蛋白生成

P.g-LPS 处理后细胞炎症因子IL-6、TNF-α mRNA 表达上升（P＜0.001，P= 0.005）。PssL-NAC降低了P.g-LPS 诱导的细胞炎症因子IL-6（P＜0.001）和TNF-α（P＜0.001）的升高。相比于对照组和P.g-LPS 组，PssL-NAC 组COL1 基 因 表 达 升 高（P＜0.001，P＜0.001），但NAC 组细胞COL1 的基因表达较对照组下降（P= 0.022）。与其他三组相比，PssL-NAC 组COL3 基因表达升高，但差异无统计意义（P＞0.05）（图5）。

Figure 5 mRNA expression of inflammatory factors and collagen of human gingival fibroblasts in different treatment groups图5 不同处理组人牙龈成纤维细胞相关炎症因子和胶原蛋白的mRNA 表达情况

2.6 PssL-NAC 在炎症环境下促进细胞迁移

与对照组相比，P.g-LPS 处理后细胞迁移能力在3、6、12h 后显著下降（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）。与P.g-LPS 组相比，PssL-NAC 组在P.g-LPS刺激3、6、12 h 后能够显著促进炎症状态下的细胞迁移（P＜0.001，P＜0.001，P＜0.001）。在P.g-LPS刺激12 h 后，PssL-NAC 组细胞融合程度较NAC 组更高（P= 0.005），细胞融合程度与对照组无显著差异（P=0.542）（图6）。

Figure 6 Migration of gingival fibroblast cells in different treatment groups图6 不同处理组人牙龈成纤维细胞迁移情况

2.7 PssL-NAC 通过TLR4-NF-κB 降低细胞炎症反应

P.g-LPS 刺激后p65 蛋白表达升高（P=0.008）。NAC 和PssL-NAC 处理后细胞TLR4 蛋白表达较P.g-LPS 组显著降低（P=0.008，P＜0.001），但与NAC 组相比，PssL-NAC 对TLR4 蛋白水平的抑制更加明显（P= 0.008）。NAC 处理后细胞p65 蛋白表达较P.g-LPS 组下降（P= 0.034），PssL-NAC 处理细胞后，细胞p65 蛋白表达与P.g-LPS 组差异更加显著（P＜0.001），但与NAC 组无显著性差异（P= 0.564）。NAC 处理细胞后，细胞p-p65 蛋白表达升高，但与对照组和P.g-LPS 组无显著性差异（P= 0.096，P= 0.140）。但PssL-NAC 组p-p65 蛋白的表达较对照组、P.g-LPS 组、NAC 组均下降（P=0.023，P=0.016，P＜0.001）（图7）。

Figure 7 Protein expression of Toll-like receptor 4-nuclear factor-κB pathway of gingival fibroblast cells in different treatment groups图7 不同处理组人牙龈成纤维细胞Toll 样受体4-核因子-κB 信号通路蛋白表达情况

3 讨 论

牙周炎是一种慢性炎症性疾病，可导致牙周支持组织的破坏。近年研究认为，大多数牙周组织的损伤是由白细胞、补体和ROS 参与的宿主固有免疫反应的联合效应［7］。局部过量的ROS 已被认为是牙周炎症加重的主要原因之一。尽管氧化应激的损伤作用已经十分明确，但生理浓度的ROS 参与的细胞生理信号传导同样重要［8］。因此，如何调控氧化应激环境，维持适宜的ROS 水平是治疗牙周炎的潜在靶点［9］。

近年来研究者们针对高水平ROS 环境研发了各类纳米递送系统［10-11］，其中智能响应型纳米释药体系具有生物安全性好、药物利用率高、减少药物局部积累等优势［12-14］。PssL-NAC 是一种智能响应释放、药物的纳米颗粒，其智能响应特性依赖连接PEG-PCL 分子［15-16］的硫缩酮键（thioketal linkages，TK）。在ROS 升高时TK 断裂，纳米颗粒裂解，纳米颗粒内部包裹的药物随之释放［5,17-18］。牙龈成纤维细胞是牙周组织再生修复的关键细胞之一［19-20］，在以P.g-LPS 为主的细菌毒力因子刺激下，牙龈成纤维细胞长期处于氧化应激状态，细胞内炎症介质激活，加重牙周组织炎症反应［21］，影响细胞迁移［22］，不利于组织再生。因此本实验使用PssLNAC 作用于炎症状态下的人牙龈成纤维细胞，观察PssL-NAC 的作用效果及机制。

虽然过量ROS 会造成组织损伤，加剧炎症发展，但其作为生理活动必备的第二信使，适宜浓度的ROS 对组织再生是有利的［23-25］。在本实验研究结果显示PssL-NAC 能在P.g-LPS 浓度升高的情况下维持细胞内ROS 在约2 倍对照组水平，而NAC清除由P.g-LPS 诱导的全部ROS，最终细胞内ROS 水平与对照组相当。根据RT-qPCR 实验结果，P.g-LPS 升高导致IL-6 和TNF-α 基因表达升高，NAC 和PssL-NAC 均能使炎症因子表达下调，但PssL-NAC 维持了稍高水平ROS 后，胶原蛋白表达较NAC 组高。细胞迁移实验也同样证明了维持了稍高水平ROS 能使炎症情况下细胞迁移能力更接近于对照组。

在牙周愈合过程中，HGFs 是增殖期和重塑期的关键细胞。HGFs 在伤口愈合的早期和晚期分别分泌COL1 和COL3。COL1 主要存在于牙龈结缔组织中，分布于整个固有层,纤维粗大成束，是促进伤口修复和硬组织再生（包括骨、牙本质和牙骨质）的必要胶原纤维。COL3 含量较少，且只在固有层中弥散分布，在增强细胞黏附和细胞增殖方面发挥着重要作用，并在软组织伤口收缩中促进弹性血管生成［26］。有研究表明，在牙龈成纤维细胞中COL1 的表达不及牙周膜细胞多，COL3 的表达更低，其原因可能是成纤维细胞分泌的COL1 和COL3分泌到细胞外作为基质成分，因此在细胞内的胶原蛋白水平显著下降［27］。在本实验中观察了PssLNAC 预处理12 h 和P.g-LPS 处理6 h 后细胞内COL1 和COL3 的表达差异，细胞内基因的表达能够反映牙龈成纤维细胞的功能状态，但不能反映细胞内外的胶原纤维总生成量，未来仍需进一步实验观察PssL-NAC 对胶原沉积的影响。因此本实验的局限性在于并未取得PssL-NAC 在促进胶原生成的直接证据，但RT-qPCR 的结果也侧面反映了PssL-NAC 通过调节细胞内适宜浓度的ROS，细胞合成胶原能力增强，细胞功能得到恢复。

研究表明细菌LPS 刺激后主要通过Toll 样受体激活转导信号，激活细胞内炎症信号通路［28-29］。TLR4-NF-κB 与炎症反应和氧化应激高度相关，ROS 激活NF-κB 信号通路，促进NF-κB 磷酸化［30］，进一步导致促炎细胞因子和趋化因子的表达［31］，触发炎症反应，加重牙周组织破坏［32］。本实验中，P.g-LPS 导致HGF 细胞中p65 蛋白表达升高，PssLNAC 比起NAC 更能显著降低TLR4-NF-κB 通路的关键蛋白表达，揭示了PssL-NAC 调节HGFs 细胞ROS、缓解细胞炎症反应的机制。

综上所述，PssL-NAC 能够智能调节细胞内适宜浓度的ROS，通过TLR4-NF-κB 通路缓解细胞炎症反应、促进胶原生成，保护炎症状态下的细胞迁移功能，本研究为PssL-NAC 作为牙周治疗的新策略奠定了实验基础。

【Author contributions】Qiu XY performed the experiments and wrote the article.Song LT analyzed the data and wrote the article.Ren SS analyzed the data and revised the article.Miao LY designed the study, conceptualized and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.