白酒酿造中丙酸菌及应用的研究进展

张 维，牟飞燕，陈 玫，董孝元，常 煦，方尚玲，陈茂彬*

（1.湖北工业大学 生命科学与健康工程学院 工业发酵省部共建协同创新中心 发酵工程教育部重点实验室 工业微生物湖北省重点实验室，湖北 武汉 430068；2.黄鹤楼酒业有限公司，湖北 武汉 430068；3.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌 443000）

中国白酒是以谷物（高粱、大麦、大米、玉米、糯米等）为主要原料，经蒸煮、糖化发酵（特制的糖化发酵剂如大曲、小曲、麸曲等中微生物与酶作用）生成糖、酸和醇等物质，再经蒸馏、陈酿、勾兑制成传统蒸馏酒[1-3]。白酒中水和乙醇约占98%，微量成分物质占2%左右[4-5]，中国白酒十二大香型之间的差异主要由这2%的微量成分决定。微量成分主要由酯类、醇类、酸类、醛酮类等组成[1]，其中酸类物质占总量的14%～16%[6]，主要包含乙酸、乳酸、己酸和丁酸[7]。白酒中的酸类物质主要作为呈味物质，与乙醇酯化成酯类物质，进一步影响白酒的风味。

相较于乙酸、乳酸、己酸和丁酸在白酒中的含量，丙酸的含量偏低，但对不同香型白酒的风味形成都具有不同程度的作用。作为微量成分中有机酸之一，丙酸及丙酸乙酯对白酒的风味组成具有一定的贡献。白酒风味中，丙酸与丙酸乙酯分别呈现出酸性气味和菠萝香香味、味略涩、似芝麻香。徐军[8]利用气质联用（gas chromatography-massspectrometry，GC-MS）技术在浓香型白酒中检测到丙酸及丙酸乙酯。赵文武等[9]利用气相色谱法在酱香型白酒中检出丙酸及丙酸乙酯。郝俊光等[10]利用高效液相法在米香型白酒中检测到丙酸及丙酸乙酯。丙酸及丙酸乙酯其含量在阈值范围内其作用与酿造过程中丙酸菌的产酸能力具有正相关关系，丙酸乙酯以丙酸为基础合成物质，所以丙酸菌的产酸能力关乎着丙酸乙酯的合成量。

在国外，丙酸菌的首次重要出现可以追溯到1828年，对于丙酸菌的研究大多数集中于乳制品生产中丙酸菌的作用以及分类学的问题，而在白酒行业中报道较少[11]；在国内，对于丙酸菌的研究较早于20世纪90年代后期白酒行业从业者提出利用丙酸菌降低浓香型白酒酿造中的乳酸含量[12]。辛秀明[13]研究发现，丙酸乙酯作为特香型白酒的主体物质，丙酸菌对特香型白酒风味的形成有着重要作用，然而，近几年在白酒酿造中相关学者有所触及到丙酸菌与产酯霉、己酸菌、乳酸菌共培养以增加丙酸乙酯的含量，降低乳酸含量，但是对丙酸菌在白酒酿造中的代谢途径及对不同香型白酒风味的贡献相关报道较少。

本文从白酒酿造中产酸微生物、丙酸菌的代谢途径以及在白酒酿造中的应用3个方面综述了丙酸菌应用于白酒酿造中的研究进展，旨在为今后丙酸菌应用于生产实践、提高白酒品质起到一定的借鉴作用。

1 白酒酿造中产酸微生物

在白酒酿造中，四大酸（己酸、乙酸、乳酸、丁酸）产生菌被相关学者络绎不绝的研究，其种类及形态特征总结见表1。侯小歌等[14]从宋河中高温大曲和中温大曲中进行醋酸菌的分离得到6株醋酸菌，分别为氧化葡糖杆菌（Gluconobacter oxydans）、巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）和醋化醋杆菌（Acetobacter aceti），并筛选出产酸较快且产酸量最大的醋化醋杆菌（Acetobacter aceti）AAB4。赵皓静等[15]从浓香型白酒酒醅中筛选出一株耐酸产酸特性较好的耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）FBKL1.0204，耐酸特性研究表明，在乳酸、乙酸和盐酸酸化的酸性发酵环境中，菌株FBKL1.0204能耐受pH 4的酸性环境，极端生存pH值为3；产酸特性研究表明，菌株FBKL1.0204为异型乳酸发酵，主要代谢生成乳酸和乙酸。李霄霄[16]从酱香型白酒酒醅和大曲中分离得到25株乳酸菌，并筛选出了耐乳酸、耐酒精、耐高温的高产L-乳酸植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici），对其产L/D-乳酸以及代谢产物进行研究，结果表明，植物乳杆菌GT-L-22的乳酸产量最高为65.12 g/L，乳酸片球菌GT-L-56的乳酸产量为62.28 g/L。衡文[17]在厌氧条件下，通过传统培养技术从浓香型白酒窖泥富集液内分离筛选得到32株高产丁酸的功能菌，通过响应面法对菌株AB2RH05-2发酵产丁酸进行了培养基优化，并在此基础上采用单因素法对其发酵产丁酸的培养条件进行了优化，最终丁酸产量为15.5 g/L，相比优化前（3.32 g/L）提高了3.7倍。彭志云等[18]从浓香型白酒窖泥中分离出丁酸产量高达14.23 g/L的酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）。彭兵等[19]从优质窖泥中分离得到己酸产量可达4.36 g/L的克氏梭菌（Clostridium kluyveri）。晋湘宜等[20]从湖北某酒厂优质窖中筛选出了己酸产量高达9.4 g/L的速生梭菌（Clostridium celerecrescens）。辛秀明[13]从特香型白酒窖泥及大曲中分离得到4株丙酸菌，并筛选出了耐酸性强、乳酸利用率高、丙酸产量高的詹氏丙酸杆菌（Propionibacterium jensenii）。

表1 产酸微生物种类及形态特征Table 1 Species and morphological characteristics of acid-producing microorganisms

白酒酿造过程中，醋酸菌、乳酸菌、丁酸菌和己酸菌在发酵过程中产生的酸类物质（己酸、乙酸、乳酸、丁酸）是白酒风味物质的主要成分之一，由丙酸菌所产丙酸虽不是白酒风味中主要成分之一，但是在酱香型白酒中有检测出含量在100 mg/L以上的丙酸[9]、通过GC-MS仪器于浓香型白酒中检测到丙酸乙酯[8]，丙酸菌低于四大酸菌于白酒风味的贡献，但是丙酸菌的存在可一定程度上解决四大酸比例失调的问题，乳酸菌较其他三大酸菌适应性更强，生长繁殖代谢突出使其在白酒酿造中处于优势地位，尤其在浓香型白酒酿造中，因此，丙酸菌利用乳酸发酵特性可得以发挥重要作用；而且，丙酸菌所产丙酸为丙酸乙酯的前体物质，其含量直接影响着丙酸乙酯的合成，丙酸乙酯作为白酒风味物质的成分之一，对白酒的品质起着不容小觑的作用，可见丙酸菌在白酒酿造中的存在不可忽视。

2 丙酸菌简介

丙酸产生菌株主要集中在丙酸杆菌属，1928年VAN NIEL C B[24]对丙酸菌作了比较详细的研究。丙酸杆菌属多数为厌氧菌，有多个种和亚种，但是不同种间对氧的耐受性不同[23]。乐华爱等[25]于1986年从沼气发酵液中分离得一个新种，并命名为北京丙酸杆菌（Propionibacterium beijingense）；程志娟等[26]于1988年分离得到一株丙酸菌，并命名为丙酸菌津轻-10，且将其应用在浓香型白酒酿造中降低了酒中乳酸及酯类含量；张付旺等[27]将丙酸菌津轻-10应用在浓香型白酒发酵中发现，丙酸菌津轻-10可以起到“增己降乳”的作用。

2.1 丙酸菌的生理特性

丙酸菌是一种厌氧菌，需要在缺氧或微氧环境下生长，革兰氏阳性，不运动，适宜的生长温度为30～37 ℃、pH值为6.5～7.5，含有丙酸盐的培养基有利于发酵产生丙酸[28-29]。丙酸菌具有较强的抗氧化特性，可以降低细胞内游离基的含量，减轻细胞对氧化应激的反应[30]。在高浓度渗透压环境下，水分子会从细胞内向外移动，导致细胞脱水，进而影响生理过程和代谢产物，丙酸菌具有较强的渗透适应性，能够在高浓度溶液中生存和繁殖[31-32]。

2.2 丙酸菌的代谢途径及产物

丙酸菌的代谢途径中，以乳酸或葡萄糖为发酵底物的发酵产物分别有丙酸、乙酸、琥珀酸及少量的CO2。如图1所示，乳酸在乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）的作用下生成丙酮酸；葡萄糖在细胞中通过糖降解途径生成磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvic acid，PEP），其中糖降解包括己糖二磷酸途径（embden-meyerhof-parnas pathway，EMP）和磷酸戊糖途径（hexose monophosphate pathway，HMP）[33]。磷酸烯醇式丙酮酸作为一种高能中间化合物可以转化生成丙酮酸和草酰乙酸[34-35]。草酰乙酸经过琥珀酸途径生成琥珀酸；少量的参与到乙酸途径生成乙酸，部分丙酮酸参与到Wood-Werkman循环生成丙酸，另一较少的部分作为碳源生成菌体的组成部分[36]。

图1 丙酸菌的代谢途径Fig.1 Metabolic pathways of propionic acid bacteria

在乙酸生成途径中，经酶复合体的作用下，丙酮酸生成乙酰辅酶A（acetyl coenzyme A，acetyl-CoA）且反应过程中辅酶A（CoA）转化生成CO2；乙酰辅酶A具有高能硫酯键经酶的催化易生成乙酰磷酸；最后，在乙酰基酶（acetylase，Ace）的作用下生成乙酸[37-39]。

在Wood-Werkman循环途径中，丙酮酸在草酰乙酸转羧基酶（oxaloacetic transcarboxylase，OTC）的作用下生成草酰乙酸，经苹果酸脱氢酶（malic dehydrogenase，MDH）作用下草酰乙酸生成苹果酸，苹果酸在富马酸酶（fumarase，Fas）的作用下生成富马酸，在琥珀酸酶（succinase，Scs）的作用下富马酸生成琥珀酸。琥珀酸进一步转化生成琥珀酰辅酶A和甲基丙二酰辅酶A，甲基丙二酰辅酶A在草酰乙酸转羧基酶的作用下生成甲酰基辅酶A。最后，在丙酰辅酶A和琥珀酸经过丙酰辅酶A、琥珀酸辅酶A转移酶催化作用后，生成了丙酸和琥珀酸辅酶A[40-42]。

据相关报道，理论上以乳酸为底物发酵过程中，3 mol乳酸生成2 mol丙酸、1 mol乙酸、1 mol CO2、1 mol H2O和能量；在EMP途径中1 mol葡萄糖生成2 mol丙酮酸、2 mol还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）和能量；HMP途径中，3 mol葡萄糖生成5 mol丙酮酸、6 mol二氧化碳、12 mol NADH和6 mol H+；乙酸途径中，1 mol丙酮酸生成1 mol乙酸、1 mol CO2、1 mol NADH和1 mol腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）；Wood-Werkman循环途径中，1 mol丙酮酸生成1 mol丙酸、2 mol烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）和1 molATP[13]。

综上，在理论层面可得到丙酸菌在代谢过程中以葡萄糖和乳酸为发酵底物产丙酸的生化反应方程式：

3 丙酸菌在白酒酿造中的应用

由丙酸菌发酵生成的丙酸能抑制微生物合成丙氨酸，主要抑制酵母和霉菌的生长，从而起到抗菌作用，白酒酿造过程中可调控微生物区系分布，在存放过程中可防止腐败菌的生长。丙酸乙酯的香味主要是菠萝香香味，味略涩、似芝麻香，在不同香型白酒中都有检测到，如酱香型白酒、浓香型白酒、清酱兼香酒、特香型白酒等，其中特香型白酒以丙酸乙酯为主体香[43]。

3.1 促进丙酸乙酯的合成

丙酸菌产生的丙酸与乙醇于酒醅中共存，在特异性酶的作用下合成的丙酸乙酯都是白酒风味成分组成部分，丙酸乙酯的合成是以丙酸为基础物质，丙酸含量与丙酸乙酯的合成量具有正相关性，即丙酸菌的存在可促进丙酸乙酯的合成；且丙酸具有酸性气味、丙酸乙酯有着菠萝香香味、味略涩、似芝麻香。

以山西“汾酒”为代表的清香型白酒具有清香纯正、诸味协调、余味爽净等特点，主体香乙酸乙酯与乳酸乙酯配比协调[42]。四川“泸州老窖”作为浓香型白酒的典型代表，其风味特征为窖香浓郁、绵甜爽净和回味绵长，主体香是己酸乙酯[44]。以贵州“茅台”为主要代表的酱香型白酒，风味特征主要为酱香细腻、醇厚柔和、回味长久，主要香气成分未定，赵文武等[9]通过对酱香型白酒中风味物质的分析发现，检测出58种风味物质中含量在100 mg/L以上的物质达10余种，其中有乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙酸、丙酸等，具体香气成分有待研究。

以江西“四特酒”为代表的特香型白酒香气幽雅舒适、诸香协调、柔绵醇甜回味悠长，主体香为丙酸乙酯[43]。特香型白酒酿造中，丙酸菌对醛类的影响呈现出不规律性、一定范围内酸类物质的变化与菌液浓度呈正相关性、酯类物质中丙酸乙酯与乙酸乙酯随着菌液浓度增加呈上升趋势而乳酸乙酯反之、醇类物质几乎无影响；以丙酸乙酯为主体香的特香型白酒，将丙酸菌应用在特香型白酒酿造中可提高特征风味物质丙酸乙酯含量，提高特型白酒品质[13]。

3.2 降低乳酸及乳酸乙酯的含量

乳酸乙酯于白酒香气成分担任着重要角色，尤其是作为清香型白酒中的主体香成分之一[45-46]，乳酸乙酯含量较高导致酯类物质配比不协调使白酒香气单一，带涩味且缺乏绵柔感[47-48]。李俊辉等[49]研究发现，浓香型白酒酿造中由曲或窖泥带有乳酸菌在适宜的生长情况下迅速生长繁殖，代谢大量的乳酸在酶的催化下生成大量的乳酸乙酯导致浓香型白酒主体香（己酸乙酯）与乳酸乙酯的比例失调，造成酒的风味、口感较差。

乳酸菌根据其适应性强的特性，在开放的白酒酿造过程中利用底物发酵生成大量的乳酸[50]。乳酸、葡萄糖以及其他可作为碳源的物质共存的情况下，丙酸菌优先利用乳酸（见图1），乳酸在乳酸脱氢酶（LDH）的作用下生成丙酮酸，再经Wood-Werkman循环途径生成丙酸及相应的副产物使乳酸含量降低，从而使酒醅中的酸度得以调节；乳酸为乳酸乙酯合成的前体物质，其含量与乳酸乙酯合成量呈正相关关系，乳酸含量的降低将导致乳酸乙酯的合成量减少，使得酿造白酒中的酯类物质比例更协调、口感更佳[51]。

3.3 增加白酒微量成分

丙酸菌以乳酸、甘油、葡萄糖等物质为碳源作发酵底物，生成丙酸及副产物，如乙酸、琥珀酸、CO2等[52]。丙酸、乙酸和琥珀酸与乙醇共存于酒醅中时经特异性酶的催化分别生成丙酸乙酯、乙酸乙酯和琥珀酸乙酯。丙酸乙酯与乙酸乙酯分别为特香型和清香型白酒的主要风味物质，将丙酸菌发酵液置于两种香型的酒醅或窖池中可改善白酒的风味，相较于清香型白酒，特香型白酒受丙酸菌影响更大，根据丙酸菌代谢过程得到的生化反应可知乙酸的产量小于丙酸，且丙酸乙酯在特香型白酒风味物质中相较于其他酯类物质占比较大[53]。

4 展望

国内外学者聚焦于丙酸菌代谢产物的应用或提取，如丙酸作为防腐剂、甜味剂应用于食品行业，维生素B12的合成路径及提取工艺优化，较少报道丙酸菌在不同香型白酒酿造中的应用，这与丙酸对白酒风味形成的贡献及丙酸菌在白酒酿造中的产量有一定关联；同时，丙酸可作为甜味剂应用于食品行业，在白酒酿造过程中丙酸是否有对白酒风味中甜味具有贡献，这需要相关学者进一步研究；但是，白酒作为中国传统的蒸馏酒，国外学者对此的研究更甚微，因此，丙酸菌在白酒酿造中代谢机理及丙酸和丙酸乙酯对白酒风味的影响机理展开深入研究是非常必要的。

根据相关文献报道，以白酒风味为出发点，考察白酒酿造中丙酸菌代谢途径以及如何影响白酒风味，在这方面应该有更具体的措施。当前，已有相关学者将丙酸菌与产酯霉菌共培养应用在特香型白酒生产中有效提高了丙酸乙酯的含量，丙酸具有抑菌活性，在产酯霉菌与其他霉菌之间，丙酸是否能够抑制其他霉菌的生长从而使得产酯霉菌能够获得更多的营养物质代谢，以及两者在共培养过程中相互影响机制有待商榷[13]；浓香型白酒酿造中出现己酸乙酯产量不够、乳酸乙酯含量超标频频报道，相关学者提出利用作为乳酸降解菌代表--丙酸菌将其于酒醅中与己酸菌、乳酸菌共培养发酵，实现“增己降乳”、“增乙降乳”和“增丙降乳”，以此来提升酒的品质，但是其对应机制还需更详细、深入的探讨。

据目前相关报道丙酸菌、己酸菌和乳酸菌于酒醅中共培养时，理论上乳酸菌利用葡萄糖作碳源发酵生成乳酸，丙酸菌利用乳酸生成丙酸及副产物乙酸等，使得环境pH得以调节更适宜于己酸菌利用乙醇发酵生成己酸，对应的乙酯类物质含量受到影响，从而实现“增己降乳”、“增乙降乳”和“增丙降乳”；但是，实际培养过程中丙酸菌与乳酸菌都能对葡萄糖进行代谢，两者之间存在着“竞争关系”，谁对葡萄糖更具竞争力有待研究；部分含有活细胞丙酸菌（詹氏丙酸菌、特氏丙酸菌）具有较强的抑菌活性，其作用的体现来源于丙酸杆菌体内含有抗菌活性肽，主要是抑制霉菌和酵母的生长，这对于己酸发酵及己酸乙酯的合成是否有影响且影响机制是什么，需进一步探讨。

综上所述，以期在未来的研究中能够将丙酸菌应用在不同香型白酒酿造中，且可利用代谢组学、蛋白质组学、基因组学、风味组学和转录组学等相关组学技术以及细胞模型研究对其产生的作用机制。