响应面法优化柘果白兰地原酒发酵条件

吴隽松，滕飞翔，杨留才*

（江苏医药职业学院 基础医学部，江苏 盐城 224005）

柘树又名黄金木，桑科植物，是素有“南檀北柘”之称的名贵树种，其树根和树皮可入药[1]。近期研究发现，柘树的树根有抗炎[2]、抗肿瘤[3]、抑制α-葡萄糖苷酶活性[4]和降血压[5]的作用。柘树的树茎被当作原料制作糖浆和颗粒制剂，治疗消化道肿瘤。柘树的树茎中含有一种黄色的着色剂，是古代皇家龙袍的染料[6]。在很长的一段时间里，柘树的树叶一直被制成功能性茶饮，同时也是养蚕行业完美的食物来源[7]。柘果是柘树的果实，糖类成分含量为1.801～2.402 g/L[11]，含有黄酮[12]、氧化蒽酮[13]、生物碱[14]和有机酸[15]等具有药用价值的化合物[8-14]。在韩国，柘果的开发利用起步较早，柘果被制成果汁、果酱、果酒和其他保健食品[15]。柘木在我国栽培时间较早但对柘果的开发起步较晚，由于柘果不耐储存，冷藏条件下可以保鲜一周左右，冷藏温度较低或者时间较长都会直接影响柘果的品质和口感。因此对柘果的开发利用是一项值得研究的课题。

白兰地起源于法国，狭义上讲，是以葡萄为原料发酵后经蒸馏得到的高度酒，再经橡木桶贮存而成。未经蒸馏的白兰酒精度较低，经二次蒸馏后成品酒的酒精含量约为40%vol。白兰地大多是以葡萄为原料，也有一些以其他水果为原料酿造的，这种白兰地会添加水果的名称，如蓝莓白兰地、山楂白兰地等[16]。本试验以柘果为原料酿造白兰地，对其发酵条件进行优化，以期为柘果在中国的开发利用提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柘果：山东省平阴县东阿镇鑫合种植农民专业合作社；柠檬酸（食品级）：北京盒子生工科技有限公司；液体果胶酶（酶活力8万U/mL）：河北润步生物科技有限公司；白砂糖：市售；葡萄酒活性干酵母SY：安琪酵母股份有限公司；焦亚硫酸钠（食品级）：陕西源优生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HH-2 水浴锅：常州天瑞仪器有限公司；PHSJ-5T pH 计：上海仪电科学仪器有限公司；ZWYRD2403 恒温培养箱：上海智城分析仪器制造有限公司；UV3000分光光度计：上海精科实业有限公司；WAY-32 糖度折光仪：上海光学仪器五厂有限公司；L18-Y915S破壁机：九阳股份有限公司；CJM-549酒精计（0%vol～100%vol）：衡水创纪仪器仪表有限公司；QP2010气相色谱-质谱联用仪（gas chromatographymassspectrometry，GC-MS）：岛津（上海）实验器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柘果白兰地发酵工艺流程及操作要点

柘果→带皮破碎→柠檬酸调酸→加果胶酶解→调节糖度→加焦亚硫酸钠→灭菌→加酵母菌粉→发酵→一次蒸馏→二次蒸馏→加入中度烘焙橡木片→过滤→柘果白兰地

原料处理：挑选表皮无破损、无腐烂的完整柘果，自来水流动冲洗后晾干。

破碎：使用破壁机破碎20 s，粒度为60目。

调节酸度：使用柠檬酸调节pH至3.5。

酶解：将柘果汁与纯净水按1∶1.5（V/V）的比例混合，加入0.1%果胶酶，在50 ℃条件下酶解2 h。

调节糖度：加入白砂糖将初始糖度调整为24°Bx。

灭菌：加入0.01%焦亚硫酸钠，灭菌2 h。

酵母菌接种：按照1 L果汁加2 g果酒酿造专用酵母菌粉的比例接种酵母，使用前用30 ℃无菌水将酵母粉活化30 min。

发酵：发酵容器上安装s型单向排气阀，排气阀中加入少量无菌水（发酵过程中注意及时添加无菌水，使容器一直处于密闭状态），既能使发酵容器密闭，又能达到将发酵过程中的气体排出的目的。将发酵容器置于28 ℃恒温恒湿培养箱中发酵9 d，期间定时搅拌。

蒸馏：采用蒸馏装置进行一次蒸馏和二次蒸馏。一次蒸馏时温度80 ℃，流出酒酒精度降低至5%vol时停止接酒；二次蒸馏时温度65 ℃，流出酒酒精度降低至5%vol时停止接酒，并去掉酒头和酒尾。

添加橡木片：按照1 L白兰地添加5 g中度烘焙橡木片的比例添加橡木片，浸泡4周。

过滤：用三层纱布进行过滤，即得柘果白兰地。

1.3.2 柘果果酒发酵条件优化单因素试验

初始糖度：在发酵时间为7 d、发酵温度为28 ℃、酵母菌添加量为0.2%的条件下，分别考察不同初始糖度（16°Bx、20°Bx、24°Bx、28°Bx、32°Bx）对柘果白兰地感官评分的影响。

发酵时间：在发酵温度为28 ℃、酵母菌添加量为0.2%、初始糖度为24°Bx的条件下，分别考察不同发酵时间（7 d、8 d、9 d、10 d、11 d）对柘果白兰地感官评分的影响。

酵母菌添加量：在发酵时间为7 d、发酵温度为28 ℃、初始糖度为24°Bx 的条件下，分别考察不同酵母菌添加量（0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%）对柘果白兰地感官评分的影响。

1.3.3 柘果果酒发酵条件优化响应面试验

基于单因素试验结果，以初始糖度（A）、发酵时间（B）和酵母菌添加量（C）为考察因素，使用Design-Expert 8.0.6.1软件，以柘果白兰地感官评分（R）为响应值，设计3因素3水平响应面试验优化柘果果酒发酵条件，响应面试验因素与水平见表1。

表1 柘果果酒发酵条件优化响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology for fermentation process optimization of Cudrania tricuspidata wine

表2 柘果白兰地感官评分标准Table 2 Sensory evaluation standards of Cudrania tricuspidata brandy

1.3.4 测定方法

感官评定：由15名酿造专业的评审员组成评价小组，以GB/T 11856—2008《白兰地》的感官要求为感官评价参考标准，从外观、香气、口感和风格四个方面对样品进行打分，满分为100分，取15人的平均分。

总酸、总糖含量：采用GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的检测方法测定[17]；甲醇含量采用GB 5009.266—2016 食品安全国家标准《食品中甲醇的测定》中的检测方法测定[18]；乙醇含量采用GB 5009.225—2016 食品安全国家标准《酒中乙醇浓度的测定》中的检测方法测定[19]；总酯含量采用GB/T 11856—2008《白兰地》中的方法[20]。

挥发性风味物质采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）法测定[19]。

（1）样品前处理：准确取3 mL样品置于30 mL固相微萃取采样瓶中，加入1 μL质量浓度为10 μL/mL乙酸戊酯为内标，加入3.0 mL去离子水和0.3 g NaCl，放入磁力转子，密封后将样品瓶置于65 ℃水浴中热平衡10 min，磁力搅拌器速度设置为800 r/min，用正己烷清洗萃取针头表面并对其进行活化，将活化后的萃取针头插入样品瓶内，推出纤维头，使之距样品液面约8 mm，顶空萃取50 min。萃取完毕迅速取出萃取针头，并将萃取针头迅速插入气相色谱质谱联用仪的进样口中热解吸6 min，进样。

（2）气相色谱条件：固相微萃取针头型号为75 μm CAR/PDMS。采用Agilent HP-5毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；载气为高纯He（99.999%），流速1 mL/min，不分流进样；进样口温度250 ℃；升温程序：起始温度40 ℃，保留10 min；以5 ℃/min升至90 ℃，保留5 min；再以2 ℃/min升至180 ℃，保留5 min；最后以20 ℃/min升至280 ℃。

（3）质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子轰击能量70 eV；离子源温度230 ℃；质量扫描范围25～450 amu；辅助温度280 ℃；扫描模式Scan。

（4）定性定量方法：检测出的物质根据相似度和保留指数，通过美国国家标准与技术研究院（national institute of standards and technology，NIST）20谱库结合人工解谱的方法进行定性（匹配度＞80%）。采用内标法对检测物进行定量分析。

1.3.5 数据处理

采用SPSS 22.0 软件进行显著性分析，P＜0.01，表示差异性极显著，P＜0.05，表示差异性显著，结果以“平均值±标准差”表示。采用Design Expert 8.0.6 软件对数据进行分析处理，采用Origin 8.5 软件作图。

2 结果与分析

2.1 柘果果酒发酵条件优化单因素试验结果

根据白兰地的酿造工艺，将发酵结束后的果酒进行二次蒸馏，得到的白兰地酒精度为40%vol，进行后续的检测以及感官评分。

2.1.1 初始糖度对柘果白兰地品质的影响

由图1可以看出，随着初始糖度的增加，总酸含量呈现下降的趋势，总糖含量呈现上升趋势，挥发性风味物质含量、感官评分呈现先上升后下降的趋势，甲醇含量呈先下降后上升再下降的趋势；初始糖度为24°Bx时，挥发性风味物质含量最高为（1.24±0.07）g/L；糖度过低时酵母菌代谢不足，糖度过高时会抑制酵母的代谢活性，都不利于挥发性风味物质的产生[21]。此时甲醇含量最低为（107±5.07）mg/L，酵母代谢途径分为糖代谢途径和其他物质代谢途径，当初始糖度过高或者过低都会引发酵母进行其他物质代谢途径，从而导致甲醇含量升高[16，22]。初始糖度为28°Bx时，感官评分值最高为（85.97±0.71）分。综合考虑，选取初始糖度20°Bx、24°Bx、28°Bx为响应面优化试验的3个水平。

图1 初始糖度对柘果白兰地品质的影响Fig.1 Effect of initial sugar content on the quality of Cudrania tricuspidata brandy

2.1.2 发酵时间对柘果白兰地品质的影响

由图2可以看出，随着发酵时间的延长，总酸含量呈现上升的趋势[23]，总糖含量呈现下降的趋势，挥发性风味物质含量、感官评分呈现先上升后下降的趋势，甲醇含量变化不明显；发酵时间为9 d时，挥发性风味物质含量达到最高，为（1.21±0.04）g/L，这种现象可能是由于风味物质的自然挥发或者被酵母代谢消耗[24-25]；发酵时间为9 d时，感官评分为（86.11±0.67）分，发酵时间为10 d时，感官评分最高为（86.25±0.49）分。综合考虑，选取发酵时间8 d、9 d、10 d为响应面优化试验的3个水平。

图2 发酵时间对柘果白兰地品质的影响Fig.2 Effect of fermentation time on the quality of Cudrania tricuspidata brandy

2.1.3 酵母添加量对柘果白兰地发酵品质的影响

由图3可以看出，随着酵母添加量的增加，总酸含量呈现升高的趋势[26]，总糖含量呈现下降的趋势，挥发性风味物质含量变化不大，甲醇含量呈现先下降后上升的趋势，感官评分呈现先上升后下降的趋势；酵母添加量为0.10%时，甲醇含量最低为（113.67±1.53）mg/L；酵母添加量为0.20%时，感官评分值最高为（84.26±0.35）分。综合考虑，选取酵母添加量0.15%、0.20%、0.25%为响应面优化试验的3个水平。

图3 酵母菌添加量对柘果白兰地品质的影响Fig.3 Effect of yeast addition on the quality of Cudrania tricuspidata brandy

2.2 柘果果酒发酵条件优化响应面试验结果

在单因素试验的基础上，以初始糖度（A）、发酵时间（B）及酵母添加量（C）为3个因素，以柘果白兰地感官评分（R）为响应值，采用Design Expert 13软件设计Box-Behnken试验，对柘果果酒发酵条件进行优化。响应面试验设计及结果见表3，方差分析见表4。

表3 柘果果酒发酵条件优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface methodology for fermentation process optimization of Cudrania tricuspidata wine

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

根据表3数据得到柘果白兰地感官评分响应值所得回归方程：

由表4可知，试验所预设的各种因素对感官评分的影响各不相同，按F值排列顺序为B＞A＞C，即对感官评分的影响为发酵时间＞初始糖度＞酵母添加量。由P值可知，交互项AC、BC对感官评分的影响显著（P＜0.05），一次项A、B、C，交互项AB，二次项A2、B2、C2对感官评分的影响极显著（P＜0.01）。失拟项P值不显著（P＞0.05），说明回归方程拟合度良好，能较好的在变量范围内反映响应值的变化情况，可以用于柘果白兰地发酵工艺的预测。

各因素交互作用对柘果白兰地感官评分影响的响应面及等高线如图4所示。由图4可知，初始糖度（A）、发酵时间（B）和酵母接种量（C）这3个因素交互作用在感官评分响应面3D图上均存在极值，AB交互作用的响应面坡度趋势陡峭，说明AB交互作用对感官评分的影响较大，与方差分析结果一致。

图4 各因素交互作用对柘果白兰地感官评分影响的响应面及等高线Fig.4 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on sensory evaluation score of Cudrania tricuspidata brandy

预测柘果白兰地最佳发酵工艺参数为初始糖度26.59°Bx，发酵时间9.61 d，酵母添加量0.21%。在此条件下，感官评分预测值为87.99分。为方便实际操作，修改发酵条件为初始糖度26.6 °Bx，发酵时间10 d，酵母添加量0.2%，在此条件下进行3次平行验证试验，最终得到感官评分实际值为86.59分，与预测值接近，证明该模型可行。

2.3 柘果白兰地品质指标

在最佳条件下发酵得到的柘果白兰地成品感官评分为86.59分，外观呈金黄色，澄清透亮，无沉淀物，香气协调且平衡，酒体醇厚饱满，细腻绵柔，无辛辣味，具有柘果白兰地的特殊风格。酒精度为40%vol、总酸含量为2.05 g/L、总酯含量为2.96 g/L、总糖含量为3.03 g/L、甲醇含量为121 mg/L（≤2.0 g/L）、挥发性风味物质含量为1.22 g/L，理化指标符合GB/T 11856—2008《白兰地》的要求。细菌总数≤50CFU/mL，大肠杆菌≤3 MPN/mL，沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌等致病菌检出。

3 结论

通过单因素试验研究初始糖度、发酵时间和酵母接种量对柘果白兰地品质的影响，进一步利用Box-Behnken响应面试验优化发酵条件。结果表明，最佳发酵条件为初始糖度26.6°Bx，发酵时间9.6 d，酵母添加量0.2%。在此发酵条件下得到的柘果果酒经蒸馏得到的柘果白兰地，外观呈金黄色，澄清透亮，无沉淀物，香气协调且平衡，酒体醇厚饱满，细腻绵柔，无辛辣味，具有柘果白兰地的特殊风格，感官评分为86.59分。酒精度为40%vol、总酸含量为2.05 g/L、总酯含量为2.96 g/L、总糖含量为3.03 g/L、甲醇含量为121 mg/L（≤2.0 g/L）、挥发性风味物质含量为1.22 g/L，品质指标符合GB/T 11856—2008《白兰地》的要求。