基于发夹DNA动态自组装树枝状聚合物放大策略的荧光传感体系测定水中Pb2+的含量

陈 贺,郑 洋,蒋旭燕,吴继魁,2,3*

(1.上海海洋大学 食品学院,上海 201306;2.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室(上海),上海 201306;3.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海 201306)

重金属是环境中水资源的主要污染物之一,一些重金属离子会严重威胁人类健康,特别是Pb2+[1]。研究表明,低浓度水平Pb2+就可对人体健康造成不可修复的损伤,对幼儿及青少年的神经系统发育造成严重损害,影响儿童智力发育[2-4]。因此,痕量Pb2+的监测对环境保护、食品安全以及人类健康具有重要意义。

Pb2+的传统检测方法如电感耦合等离子质谱法(ICP-MS)、原子荧光光谱法(AFS)和原子吸收光谱法(AAS)等[5-7]往往存在仪器笨重和昂贵、预处理复杂、分析周期长以及需要专业人员操作等缺点,难以用于现场实时测试,因此开发低成本、简单、快速、高灵敏、高选择性的Pb2+检测方法势在必行。

生物传感器为金属离子检测提供了成本低、简单、高效的方法。脱氧核酶(DNAzyme)对金属离子具有高选择性和特异性,常作为生物传感器的识别元件,广泛应用于各种靶标如DNA、微RNA(microRNA)、蛋白质和金属离子等的检测[8-10]。其中,GR-5 DNAzyme是经体外筛选出来的能特异性识别Pb2+的功能核酸,它不仅具有高催化性、化学稳定性和选择性,成本也很低[11]。

核酸等温扩增是在恒定温度下,将具有特定功能及特定序列的蛋白酶及核酸引物等添加到特定反应体系中,进而实现目标核酸序列扩增的技术[12-13]。其中:以辅助因子为蛋白酶或纳米粒子的等温扩增方法价格昂贵,操作复杂耗时[14];催化发夹自组装(CHA)等温扩增技术是一种无酶、高效的信号扩增策略,扩增过程可由单链分析物引发,底物发夹被依次打开,从而触发连续组装步骤,进而完成扩增[15-16]。由于该技术操作过程简单,具有无需聚合酶、扩增效率高等突出优势,已成为检测Pb2+的一种重要信号扩增策略[17-18]。目前CHA扩增大都是线性扩增,扩增效率不高。本工作通过扩展GR-5 DNAzyme序列,利用DNA树枝状聚合物动态立体自组装信号放大策略开发了一种无酶、高灵敏的荧光传感体系,并应用于实际水样中痕量Pb2+测定,取得了满意结果。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

FS5型爱丁堡荧光光谱仪;ThermoStat plusTM型孵育器;JY-SCZ2+型双垂直电泳仪; hemiDoc XRS型凝胶成像扫描仪。

Pb2+标准溶液:500 μmol·L-1,准确称取0.016 g Pb(NO3)2,用水溶解并转移至100 mL容量瓶中,加入硝酸0.5 mL与水5 mL,用水稀释至刻度,摇匀。使用时,用水稀释至所需浓度。

羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)缓冲液:pH 7.4,内含10 mmol·L-1Tris-HCl 、10 mmol·L-1NaCl和10 mmol·L-1MgCl2。

核酸电泳缓冲液:根据《分子克隆实验操作指南》(第三版),取适量Tris-HCl、硼酸以及乙二胺四乙酸二钠,用水溶解和稀释,配制10×TBE(Tris-HCl、硼酸以及乙二胺四乙酸二钠简称)缓冲液。

本工作使用的DNA均为高效液相色谱级,包括GR-5 DNAzyme酶链GR-5E(5′-ATCATCTCTGAAGTAGCGCCGCCGTATAGTGA-3′),底物链GR-5S(5′-TCACTATrAGGAAGAGATGATGTGATAGGGGT-3′),骨架链Y1(5′-ATGGTTGGTGGGTGGATCCGCATGACATTCGCCGTAAG-3′)、 Y2(5′-GTGTGTCTGGTGCTTACGGCGAATGACCGAATCAGCCT-3′)、Y3(5′-CGAGAGGAAGGGAGGCTGATTCGGTTCATGCGGATCCA-3′),发夹链H1(5′-CCCACCAACCAT-Dabcyl-GATGATGTGATAGGGGTACAACACTAACCTTACCCCTATCACATCATCTCTTCC-FAM-3′)、H2(5′-CACCAGACACACGGGGTACAACACTAACCTGGAAGAGATGATAGGTTAGTGTTGTACCCCTATCAC-3′)、H3(5′-CCCTTCCTCTCGTAACCTGGAAGAGATGATGTGATAGGGGTAATCATCTCTTCCAGGTTAGTGTTG-3′)。Pb(NO3)2、Tris-HCl、四甲基乙二胺(TEMED)、冰乙酸、尿素等试验所用试剂均为分析纯;试验用水均为超纯水,电阻率18.2 MΩ·cm。

1.2 试验方法

取1∶1(物质的量比)的GR-5E和GR-5S,于95 ℃恒温孵育5 min,冷却至室温(25 ℃),将得到的复合物GR-5E-S置于4 ℃冰箱中冷藏备用。取1∶1∶1(物质的量比)骨架链Y1、Y2和Y3,置于PCR管中,于95 ℃恒温孵育5 min,冷却至室温,在此温度下孵育2 h,制成Y型骨架。将适量发夹链H1、H2和H3分别溶解在Tris-HCl缓冲液中,先于95 ℃孵育5 min,放至室温,再在此温度下至少放置2 h,制得100 μmol·L-1发夹溶液备用。在Tris-HCl缓冲液加入适量Y型骨架和H1、H2和H3发夹溶液,使其浓度均达到10 μmol·L-1,涡旋混匀,于25 ℃孵育1 h,制成发夹三聚体溶液。将水样( Pb2+标准溶液、干扰离子溶液) 4 μL分别添加到96 μL含400 nmol·L-1GR-5E-S和400 nmol·L-1发夹三聚体的反应溶液中,于25 ℃孵育40 min,完成底物切割和自组装信号扩增。取100 μL上述溶液置于石英比色皿中,用荧光光谱仪测量其荧光强度,设置狭缝宽度为 1 nm,激发波长为490 nm,发射波长为520 nm,扫描范围为500～650 nm。随同进行空白试验

2 结果与讨论

2.1 荧光传感原理

3条DNA骨架链Y1、Y2、Y3反应形成Y型骨架后和3个DNA发夹链H1、H2、H3形成发夹三聚体,其中H1上3′端修饰了荧光团(FAM),5′端修饰了猝灭团(Dabcyl),发夹三聚体因荧光团和猝灭团之间发生荧光共振能量转移而保持很低的荧光背景。底物链的部分序列被设计成可以触发DNA动态自组装过程的目标链T。Pb2+存在时,底物链被切割释放目标链T。目标链T与发夹三聚体上H1部分序列杂交,使荧光团和猝灭团分开,产生荧光;H1剩余序列打开发夹三聚体上另一个发夹H2。重复上述过程,实现动态自组装,形成树枝状聚合物,产生高效放大的荧光信号,从而实现对Pb2+的高灵敏定量荧光检测。荧光传感原理如图1所示。

图1 Pb2+检测的荧光传感原理图Fig.1 Schematic of fluorescence sensing principle for detection of Pb2+

2.2 荧光传感原理的验证

2.2.1 Pb2+对目标链T的释放

通过17%(聚丙烯酰胺质量分数)尿素-聚丙烯酰胺电泳(Urea-PAGE)验证底物链扩展的目标链T能否有效释放。取30%(质量分数)丙烯酰胺凝胶液 6.8 mL、尿素 5.04 g、10×TBE缓冲液 1.2 mL、10%(质量分数)过硫酸铵(APS)溶液100 μL、TEMED 8 μL,混合后用水定容至12 mL,注入胶板,于25 ℃聚合30 min,制得17% Urea-PAGE胶。在10 mmol·L-1Tris-HCl缓冲液中分别引入10 μmol·L-1GR-5E、10 μmol·L-1GR-5S以及0, 5.0, 10.0, 50.0, 100.0 nmol·L-1内含10 μmol·L-1GR-5E-S的Pb2+,各取6 μL,分别于胶板泳道1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#上样,于 90 V电泳30 min,然后于140 V电泳直至结束,用凝胶成像扫描仪对电泳结果进行拍照。结果显示:引入GR-5E以及GR-5S时,在凝胶中观察不到目标链T条带;引入Pb2+时,可以在凝胶中观察到目标链T条带,这是因为Pb2+会激发GR-5 DNAzyme的催化活性,使之切割底物链并释放目标链T;随着Pb2+浓度的增加,目标链T条带颜色逐渐变深,被切割的底物链条带颜色逐渐变浅。以上结果表明,设计目标链T能被Pb2+有效释放,且其释放量依赖于Pb2+浓度。

2.2.2 Y型骨架的形成和扩增产物的生成

利用8%(聚丙烯酰胺质量分数)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)验证Y型骨架的形成和扩增产物的生成。将30%丙烯酰胺凝胶液2.7 mL、10×TAE 缓冲液1 mL、6.2 mL水、10% APS溶液90 μL、TEMED 10 μL混合后注入胶板,于25 ℃聚合30 min,即制得Native-PAGE胶。取溶液Y1、Y2、Y3、Y1+Y2、Y1+Y3、Y2+Y3、Y型骨架、H1+H2+H3、H1、H2、H3、Y型骨架、发夹三聚体、发夹三聚体+Pb2++GR-5E-S各5 μL,浓度均为2 μmol·L-1,分别于胶板泳道1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#、10#、11#、12#、13#、14#上样,于170 V电泳5 min,然后于110 V电泳直至结束,用 凝胶成像扫描仪对结果进行拍照。结果显示:泳道1#～3#分别对应Y1、Y2、Y3,三者迁移速率基本一致;泳道4#～6#分别对应Y1+Y2、Y1+Y3、Y2+Y3,迁移速率基本一致且慢于前3条泳道,这是因为骨架链两两之间发生了相同的交叉反应,相对分子质量增加;泳道7#对应Y型骨架,其条带较前6条泳道的迁移速率更慢,说明3个骨架链之间发生交叉反应形成了Y型骨架;泳道8#～11#分别对应H1+H2+H3、H1、H2、H3,其迁移速率基本一致,证明3个发夹之间不会发生交叉反应;泳道13#对应的是发夹三聚体的条带,其迁移速率较Y型骨架(泳道12#)以及H1+H2+H3(泳道8#)的更慢,这是由于Y型骨架分别和H1、H2、H3之间发生了碱基互补配对而形成发夹三聚体;在Pb2+加入后,GR-5E-S中的底物链被切割并释放目标链T,触发发夹三聚体的动态自组装过程,在泳道14#中出现扩增后形成的树枝状聚合物条带,表明设计的荧光扩增策略是可行的。

为进一步验证扩增产物的生成,取20 μL发夹三聚体溶液以及80 μL传感体系(内含扩增产物)溶液,用水稀释至1 mL,采用纳米粒度仪进行动态光散射测试[19],发现扩增产物的粒径约是发夹三聚体的10倍(图2),进一步证明扩增策略的可行性。

图2 发夹三聚体以及扩增产物的粒径分布图Fig. 2 Particle size distribution of hairpin trimers and amplicon

为了验证荧光传感检测Pb2+的可行性,考察了100.0 nmol·L-1Pb2+加入前后传感体系的荧光光谱,见图3。

图3 Pb2+加入前后传感体系的荧光光谱Fig.3 Fluorescence spectra of the sensing system before and after the addition of Pb2+

由图3可知,在加入100.0 nmol·L-1Pb2+后,传感体系的荧光强度显著增加,约为加入前的3倍。这主要归因于Pb2+使底物链裂解并释放目标链T,触发动态自组装过程,从而实现荧光强度的放大。

2.3 试验条件的优化

为使荧光传感性能达到最佳,以100.0 nmol·L-1Pb2+为待测对象,对传感体系中的发夹三聚体浓度(0～600 nmol·L-1)、Tris-HCl缓冲液酸度(pH 7.0～8.0)、GR-5E-S浓度(0～1000 nmol·L-1)以及扩增反应的孵育时间(0～60 min)等试验条件进行优化,所得的最优条件:400 nmol·L-1发夹三聚体、Tris-HCl缓冲液酸度pH 7.4、400 nmol·L-1GR-5E-S、孵育时间40 min。

2.4 选择性试验

在反应溶液中不添加金属离子(Blank),加入100 nmol·L-1Pb2+,分别加入500 nmol·L-1Fe2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+,加入500 nmol·L-1Fe2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+的混合离子(Mix)或加入100 nmol·L-1Pb2+和500 nmol·L-1Fe2+、Zn2+、Ni2+、Co2+、Mn2+、Ca2+、Cu2+(Mix+ Pb2+)的混合离子,上机测试,不同情况下传感体系的荧光强度如图4所示。

图4 传感体系对pb2+的选择性Fig.4 Selectivity of sensing system for pb2+

由图4可知:加入500 nmol·L-1各干扰离子后,传感体系的荧光强度相较Blank的变化很小;加入100 nmol·L-1Pb2+,传感体系的荧光强度明显增大,说明传感体系对Pb2+具有良好的选择性;加入混合干扰离子后,传感体系荧光强度相较Blank的也没有显著变化;混合干扰离子与Pb2+共存时,传感体系的荧光强度显著增强,相较Pb2+单独存在时略微降低,表明该传感体系基本不受其他金属离子的干扰,对Pb2+具有良好的选择性。

2.5 标准曲线和检出限

在反应溶液中分别添加0, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 50.0, 100.0, 200.0, 400.0 nmol·L-1Pb2+,按照试验方法测量上述溶液的荧光强度,发现传感体系的荧光强度随着Pb2+浓度的增加而增加。以Pb2+浓度为横坐标,其对应的传感体系的荧光强度为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,Pb2+浓度在0.1～10.0 nmol·L-1内和对应的传感体系的荧光强度呈线性关系,线性回归方程为y=0.032 13x+ 0.486 4,相关系数为0.993 4。

按照试验方法重复分析空白样品10次,以3倍传感体系荧光强度标准偏差(s)与标准曲线斜率(k)的比值计算检出限(3s/k),结果为19 pmol·L-1。

将本方法建立的荧光传感体系的检测时间、线性范围以及检出限与文献报道的其他荧光传感体系的进行比对,结果见表1。其中ExoⅢ代表核酸外切酶Ⅲ,UCNPs-MNPs-GNPs代表上转换纳米粒子、磁性纳米粒子和金纳米粒子组成的荧光探针, CDAu代表掺金碳点。

表1 不同荧光传感体系检测Pb2+的性能比较

由表1可知,与已报道的荧光传感体系相比,本工作开发的GR-5 DNAzyme + DNA动态自组装荧光传感体系具有较高的灵敏度和检测效率。

2.6 精密度和回收试验

采集湖水和实验室自来水水样,于6 000 r·min-1转速离心1 min,加入适量Pb2+标准溶液,配制成Pb2+浓度为1.0,5.0,10.0 nmol·L-1的加标水样,每个加标浓度水平重复测定5次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表2。

表2 精密度和回收试验结果(n=5)

由表2可知,各加标水样所得Pb2+测定值的RSD不大于15%,回收率为98.0%～108%,表明本工作所建荧光传感体系对Pb2+的检测是准确可靠的,可用于实际水样中Pb2+的快速检测。

本工作利用GR-5 DNAzyme对Pb2+的特异性识别性能,通过发夹DNA动态自组装信号放大策略构建了一种新型无酶、高灵敏的Pb2+荧光传感体系。该荧光传感体系无需额外的DNA模板或引物,由靶标触发自组装扩增,大大提高了检测灵敏度,简化了操作步骤,降低了制作成本,在环境水样的质量监测中具有良好的发展前景,且其设计概念有望应用到其他目标物的检测,为生物传感和成像领域提供借鉴。