高效液相色谱法测定复方异丙托溴铵雾化吸入溶液中杂质的含量

刘沁洁 ,崔 艳

(1.沈阳药科大学 药学院,沈阳 110016;2.上海济煜医药科技有限公司,上海 200000)

世界卫生组织2019年数据显示,全球十大死亡原因中,慢性阻塞性肺疾病(COPD)是第三大死亡原因,其死亡人数约占6%,全球疾病经济负担比重逐年递增[1]。随着全球范围多种呼吸系统病原体的流行,特别是COVID-19在全世界范围内的传播[2],使得吸入制剂得到越来越多的应用和关注[3]。吸入给药作为一种特殊的给药方式,可以直接到达病灶部位,避免首过效应[4-6]。复方异丙托溴铵雾化吸入溶液中含有沙丁胺醇和异丙托溴铵两种药物成分。沙丁胺醇作为短效β2受体激动剂[7],可以扩张平滑肌,改善呼吸困难等症状;异丙托溴铵作为抗胆碱药[8],有松弛支气管平滑肌的作用。二者联合用药,可有效改善呼吸困难等典型COPD症状[9-12]。

目前只有美国药典(USP)收录了异丙托溴铵与硫酸沙丁胺醇复方制剂的有关物质检测方法[13],并对3个杂质进行了质量控制。然而,研究发现:复方异丙托溴铵雾化吸入溶液中可能含有11个潜在杂质(已知杂质),主成分与杂质结构及名称如图1所示;USP收录的相关检测方法对这11个杂质的分离效果不佳,且缺少相关杂质定量方法的描述。鉴于此,本工作使用离子对试剂作为流动相[14],提出了一种不同于USP中描述的高效液相色谱法(HPLC)对11个潜在杂质进行系统分离,并对USP并未研究的制剂稳定性研究过程中降解出的8个杂质(硫酸沙丁胺醇相关杂质3, 8, 12以及异丙托溴铵相关杂质2, 6, 10, 11, 14)的定量分析方法进行验证,用于复方异丙托溴铵雾化吸入溶液的稳定性研究以及其中这8种杂质的质量控制,同时对其中的未知杂质进行了定性及半定量分析,以期为复方异丙托溴铵雾化吸入溶液杂质检测提供参考。

图1 2种主成分和已知杂质的结构Fig.1 Structures of 2 major constituents and known impurities

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪,配G7115A二极管阵列检测器;XSR105DU型电子天平;Five-easy型酸度计;DK-S28型恒温水浴锅。

稀释溶剂:取氯化钠适量,加水溶解并用稀盐酸(体积分数为10%±0.5%的盐酸溶液)溶液调节pH至3.3,配制成0.9%(质量分数)氯化钠溶液,备用。

系统适用性溶液:取主成分和各已知杂质对照品适量,用稀释溶剂溶解和定容,配制成含异丙托溴铵约200 mg·L-1,杂质2;6;10;11 约1 mg·L-1,杂质14约0.4 mg·L-1,硫酸沙丁胺醇约1 200 mg·L-1,杂质3;5;7;12;13约2 mg·L-1,杂质8约3 mg·L-1的混合溶液,备用。

取适量各主成分及其杂质(USP未研究的8种杂质)的对照品,用稀释溶剂溶解和逐级稀释,制作的混合标准溶液系列中各化合物的质量浓度见表1。

表1 混合标准溶液系列中各化合物的质量浓度

原料药储备溶液1:取异丙托溴铵原料药适量,用稀释溶剂溶解和定容,配制成含异丙托溴铵约200 mg·L-1的溶液,备用。

原料药储备溶液2:取硫酸沙丁胺原料药适量,用稀释溶剂溶解和定容,配制成含硫酸沙丁胺醇约1 200 mg·L-1的溶液,备用。

混合原料药储备溶液:取两种主成分原料药适量,用稀释溶剂溶解和定容,配制成含异丙托溴铵约2 500 mg·L-1和硫酸沙丁胺醇约15 000 mg·L-1的溶液,备用。

混合杂质储备溶液:取异丙托溴铵杂质和硫酸沙丁胺醇杂质对照品适量,用稀释溶剂溶解和定容,配制成含杂质2、6、10、11约12.5 mg·L-1,杂质14约5 mg·L-1,杂质3、12约25 mg·L-1,杂质8约37.5 mg·L-1的混合溶液,备用。

杂质外标溶液:取混合杂质储备溶液4 mL,置于50 mL容量瓶中,用稀释溶剂定容至刻度,备用。

硫酸沙丁胺醇及其杂质3,5,7,8,12,13对照品纯度均不小于99.0%,异丙托溴铵一水合物及其杂质2,6,10,11,14对照品纯度均不小于98.0%。乙腈、庚烷磺酸钠、磷酸、盐酸、氯化钠均为HPLC级;试验室用水为超纯水。硫酸沙丁胺醇和异丙托溴铵一水合物原料药纯度分别为99.6%和96.4%。复方异丙托溴铵雾化吸入溶液(批号20041401、20041402、20041403)均为自制,于40 ℃储存。

1.2 仪器工作条件

Agilent©Zorbax SB-Aq C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱温35 ℃;流量1.0 mL·min-1;进样量70 μL。流动相A为6.4 mmol·L-1庚烷磺酸钠溶液(用磷酸调节酸度至pH 3.8),B为乙腈。梯度洗脱程序:0～10.0 min,A为100%;10.0～60.0 min,A由100%降至75%,保持5 min;65.0～65.1 min ,A由75%跳转至100%,保持14.9 min,检测时间80 min;紫外检测波长210 nm。

1.3 试验方法

取复方异丙托溴铵雾化吸入溶液,直接按照仪器工作条件测定。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

通过全波长(190～400 nm)扫描采集两种主成分及其杂质对照品,以及强制降解样品的紫外吸收图谱,结果显示:硫酸沙丁胺醇及其杂质在近200 nm处有最大吸收,异丙托溴胺一水合物及其杂质在近190 nm处有最大吸收;强制降解样品中各未知杂质最大紫外吸收波长均接近200 nm;乙腈末端吸收波长约在190 nm附近[15]。综合考虑各物质的响应与分离效果,试验选择的检测波长为210 nm。

2.2 色谱柱的选择

试验考察了Ultimate©AQ-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)和Agilent©Zorbax SB-Aq C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)的分离效果。结果显示:Ultimate©AQ-C18色谱柱所得色谱图存在异丙托溴铵拖尾,杂质分离效果不佳等问题; Agilent©Zorbax SB-Aq C18色谱柱所得两种成分和11个杂质的分离效果均较好。因此,试验选择Agilent©Zorbax SB-Aq C18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)分离复方异丙托溴铵雾化吸入溶液中的主成分及杂质。

按照仪器工作条件测定系统适用性溶液,所得色谱图见图2。

1-Br-;2-杂质2;3-杂质3;4-沙丁胺醇;5-杂质5;6-杂质6;7-杂质7;8-杂质8;9-异丙托溴铵;10-杂质10;11-杂质11;12-杂质12;13-杂质13;14-杂质14

由图2可知,各化合物间的分离度均大于2.0,且其色谱峰峰形良好,说明各化合物可实现完全分离。

2.3 专属性试验

为了考察不同降解条件下方法的适用性,开展了强制降解试验。分别取10 mL原料药储备溶液1,2和复方异丙托溴铵雾化吸入溶液数份,在以下5组条件下进行强制降解试验:① 酸降解组,分别加入0.1 mol·L-1盐酸溶液200 μL,密封,于60 ℃水浴中放置2 h,取出后各加入0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液200 μL中和;②碱降解组,分别加入0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液200 μL,密封,于40 ℃水浴中放置2 h,取出后各加入0.1 mol·L-1盐酸溶液200 μL中和;③氧化降解组,分别加入30%(质量分数)过氧化氢溶液100 μL,密封,于室温下放置10 h;④高温降解组,分别将溶液密封于玻璃试管中,于80 ℃水浴中放置5 d;⑤光照降解组,分别将溶液密封于透明容器中,在冷白荧光灯和近紫外灯同时照明下放置12 d(光源总照度约为1.2×106lx·h、近紫外灯能量约为200 W·h·m-2);⑥未降解组,不做任何处理。结果见图3。

①-氧化降解组;②-酸降解组;③-光照降解组;④-碱降解组;⑤-高温降解组;⑥-未降解组;2-杂质2;3-杂质3; 4-沙丁胺醇 ;6-杂质6;8-杂质8;9-异丙托溴铵;10-杂质10;12-杂质12;14-杂质14;IU1-杂质RRT0.67;IU2-杂质RRT0.75;IU3-杂质RRT0.83;IU4-杂质RRT1.32;U1-杂质RRT2.55;U2-杂质RRT3.19;U3-杂质RRT3.40;U4-杂质RRT3.46;U5-杂质RRT3.71;U6-杂质RRT3.96

由图3(a)可知:异丙托溴铵单一成分强制降解试验中的杂质主要为已知杂质2,6,10,14(杂质11降解量质量分数小于0.01%);以“RRT+相对保留时间0.67,0.75,0.83,1.32”命名未知杂质(IU1, IU2, IU3, IU4),分别为杂质RRT0.67、RRT0.75、RRT0.83、RRT1.32。推测杂质2主要由异丙托溴铵中苯基丙酰基水解产生,杂质14由异丙托溴铵上羟基消去后产生,杂质6由杂质14进一步水解或杂质2上羟基消去后产生,杂质10为异丙托溴铵氮原子手性化合物。

由图3(b)可知:硫酸沙丁胺醇单一成分强制降解试验中的主要杂质为已知杂质3,8,12及相对保留时间为2.55,3.19,3.40,3.46,3.71,3.96的6种未知杂质U1,U2,U3,U4,U5,U6(命名规则同上)。其中,杂质3,8由沙丁胺醇氧化产生,杂质12由两分子沙丁胺醇脱水产生。

由图3(c)可知:将复方异丙托溴铵雾化吸入溶液在不同降解条件产生的未知杂质按照单一成分强制降解试验进行归属,主要有5种,其中主成分在氧化、光照、碱性条件下易降解。这3种条件下,异丙托溴铵中总杂质的质量分数分别为1.38%, 0.26%,1.76%;硫酸沙丁胺醇中总杂质的质量分数分别为1.16%,0.77%,0.22%;采用色谱软件计算各化合物色谱峰纯度,均不小于980[17],各化合物间分离度均不小于1.5。

在酸、碱、光照、氧化、高温降解以及不降解条件下两种主成分相关杂质基本一致,各化合物间均可有效分离,表明方法可以有效分离复方制剂中可能存在的潜在杂质,方法适用性良好。

2.4 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以各化合物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标,使用不加权的最小二乘法进行线性拟合,所得各化合物的质量浓度均在一定范围内和峰面积呈线性关系,其他线性参数见表2。

表2 线性参数、检出限和测定下限

分别以3倍、10倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果见表2。

2.5 复方药物中杂质的计算

在处方浓度水平下,异丙托溴铵一水合物和硫酸沙丁胺醇在210 nm紫外波长下的吸光度差异较大,故先将两种主成分中相关杂质分别进行归属后再进行计算:对于未知杂质主要依据单一主成分(异丙托溴铵或硫酸沙丁胺醇)的强制降解试验所得的各杂质的相对保留时间(异丙托溴铵的常见4种未知杂质按照相对于异丙托溴铵的相对保留时间0.67,0.75,0.83,1.32进行定性,沙丁胺醇的常见6种未知杂质按照对于沙丁胺醇的相对保留时间2.55,3.19,3.40,3.46,3.71,3.96进行定性)进行归属,然后根据单一主成分面积归一化法进行计算,以保证两种主成分中的杂质都能得到较为准确的定量[16]。其中:异丙托溴铵响应值较小,无法归属的不常见杂质均按照异丙托溴铵中未知杂质计算,以达到严格控制杂质含量的目的;对于已知降解杂质,归属后按照标准曲线法分别计算其含量。

当杂质2,3,6,8,10,11,12,14通过上述方法不易获得时,可采用加校正因子的自身对照法通过其对应的主成分计算其含量。异丙托溴铵、硫酸沙丁胺醇杂质校正因子(f)为异丙托溴铵和其杂质以及沙丁胺醇和其杂质的标准曲线斜率比,其中异丙托溴铵杂质2,6,10,11,14校正因子分别为0.4,0.2,1.1,0.8,0.7;硫酸沙丁胺醇杂质3,8,12校正因子分别为0.4,0.4,0.6。

2.6 精密度和回收试验

取混合杂质储备溶液2 mL,置于25 mL容量瓶中,用复方异丙托溴铵雾化吸入溶液稀释至刻度,平行配制6份,按照仪器工作条件测定,除杂质2测定值的相对标准偏差(RSD)为1.0%外,杂质3, 6,8, 10, 11, 12, 14测定值的RSD均接近于0。

取混合原料药储备溶液4 mL,用稀释溶剂定容至50 mL,作为本底溶液,按照仪器工作条件测定,用于扣除本底值;取杂质外标溶液作为外标溶液,按照仪器工作条件测定,用于计算加标量;取混合原料药储备溶液4 mL,分别加入混合杂质储备溶液2, 4, 6 mL,用稀释溶剂定容至50 mL,得到杂质浓度水平为限度值50%,100%,150%的加标样品溶液[16],每个浓度水平平行测定3次,所得各杂质回收率,结果见表3。

表3 回收试验结果

2.7 稳定性试验

取复方异丙托溴铵雾化吸入溶液约2 mL于进样小瓶中作为样品,在室温条件下放置0, 11, 28 h,按照仪器工作条件测定。结果显示,杂质2、3、6、11、14未检出,杂质8、10、12质量分数的极差为0,0.02%,0 ,表明样品在28小时内稳定。取杂质外标溶液于室温条件下放置0, 28 h,放置后各化合物的相对峰面积比不小于98.5%,说明杂质外标溶液在28 h内稳定性良好。

2.8 样品分析

按照仪器工作条件分析3批样品,结果显示:异丙托溴铵相关杂质10、14的检出量均低于测定下限;杂质2质量分数分别为未检出, 0.02%, 0.04%;杂质6质量分数均为0.03%;杂质11质量分数均为0.01%;杂质RRT1.32质量分数分别为0.05%, 0.05%, 0.03%;杂质RRT0.22(因强降解试验中未降解出该杂质,也归属为异丙托溴铵杂质)质量分数分别为0.07%, 0.08%, 0.06%。硫酸沙丁胺醇相关杂质3未检出;杂质8质量分数均为0.01%;杂质12质量分数分别为0.01%, 0.02%, 0.03%;杂质RRT2.55 质量分数分别为0.06%, 0.06%, 0.05%;杂质RRT3.19质量分数分别为0.03%, 0.03%, 0.02%;杂质RRT3.71 质量分数均为0.01%;杂质RRT3.96质量分数均为0.01%。

本工作采用HPLC测定复方异丙托溴铵雾化吸入溶液中的杂质,该方法重复性好、灵敏度高,可为复方异丙托溴铵雾化吸入溶液中杂质测定提供参考。碱、氧化和光照强制降解试验过程中产生较大未知杂质的降解产生机理有待进一步研究。