基于半胱氨酸-Fe(Ⅲ)-邻菲啰啉体系的共振光散射光谱法测定半胱氨酸的含量

刘 毅,袁 莉,袁嘉怡,储 文,马卫兴,2*

(1.江苏海洋大学 药学院,连云港 222005;2.江苏省海洋药物筛选重点实验室,连云港 222005)

半胱氨酸是一种含有巯基的非必需氨基酸,参与体内多种氧化还原反应,在人体生理过程中发挥着至关重要的作用,它在人体内的浓度水平与多种疾病相关[1-2]。半胱氨酸在食品、制药、化妆品中的应用十分广泛[3],因此建立省时、高效的检测半胱氨酸的方法对于相关产品的质量控制具有重要意义。

目前,测定半胱氨酸含量的方法有分光光度法[4-5]、荧光光谱法[6-7]、电化学法[8-9]、高效液相色谱法[10-11]、滴定法[12-13]等,这些方法大多需要高精密仪器,操作繁琐。共振光散射光谱法具有专属性强、灵敏度高、省时、简便等优点,相关应用也比较多[14-15],但是在半胱氨酸检测中的应用较少。在弱酸性伯瑞坦-罗宾森(B-R)缓冲溶液中,Fe(Ⅲ)与1个邻菲啰啉分子和4个水分子形成配合物阳离子,该配合物阳离子之间通过氢键形成配合物聚集体,从而产生共振光散射现象,在308 nm处出现强共振光散射峰[16]。当上述体系中存在半胱氨酸时,半胱氨酸能将溶液中游离的Fe(Ⅲ)还原成Fe(II)[17],Fe(II)夺取配合物聚集体中的邻菲啰啉,发生金属离子交换配位反应,使配合物聚集体解体,并形成更稳定的三邻菲啰啉亚铁配合物阳离子[Fe(C12H18N2)3]2+[16],导致体系共振光散射强度降低。基于上述作用机理,本工作提出了基于半胱氨酸-Fe(Ⅲ)-邻菲啰啉体系的共振光散射光谱法测定半胱氨酸含量的方法,并将其应用于半胱氨酸胶囊的分析。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

F-7000型荧光分光光度计;BS210S型电子天平。

半胱氨酸标准储备溶液:1.00 g·L-1,取适量半胱氨酸标准品,用水溶解和稀释,摇匀备用。

半胱氨酸标准中间液:10.0 mg·L-1,取适量半胱氨酸标准储备溶液,用水稀释100倍,摇匀备用。

Fe(Ⅲ)溶液:取适量六水合氯化铁,加入2 mL盐酸,用水稀释,配制成2.00 g·L-1Fe(Ⅲ)溶液。使用时,用水稀释成10.0 mg·L-1Fe(Ⅲ)溶液。

邻菲啰啉溶液:10.0 mg·L-1,取适量邻菲啰啉,用水溶解和稀释而成。

B-R缓冲溶液:pH 6.59,参考文献[18]配制。

半胱氨酸标准品,纯度不小于98.5%;六水合氯化铁、盐酸等试验所用试剂均为分析纯;试验用水为超纯水。半胱氨酸胶囊中的半胱氨酸标示量为72 mg·粒-1,批号分别为20210301和20211001。

1.2 试验方法

取2批半胱氨酸胶囊各5粒,将内容物分别混合均匀后,分取适量样品(相当于半胱氨酸4.00 mg)于烧杯中,用水溶解,转移至棕色容量瓶中,用水定容至100 mL。用滤纸过滤,初滤液弃去,分取1.00 mL续滤液置于10 mL棕色容量瓶中,用水定容,制得4.00 mg·L-1的半胱氨酸样品溶液。分取1.00 mL半胱氨酸样品溶液、1.50 mL 10.0 mg·L-1的Fe(Ⅲ)溶液、1.00 mL B-R缓冲溶液(pH 6.59)、2.00 mL 10.0 mg·L-1邻菲啰啉溶液于10 mL比色管中,以水定容,摇匀,室温反应10 min,待测。随同制备试剂空白。

分别取适量待测溶液和试剂空白置于1 cm石英比色皿中,调节仪器激发、发射波长(λ)相等,狭缝宽度为5 nm,扫描200～800 nm内共振光散射光谱,记录上述荧光体系在308 nm处的共振光散射强度I和I0,并计算共振光散射强度差值ΔI(ΔI=I-I0),利用标准曲线法定量。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

含0, 0.40, 0.80, 1.00, 1.20 mg·L-1半胱氨酸的荧光体系的共振光散射光谱图见图1。

曲线1～5对应的半胱氨酸质量浓度分别为0, 0.40, 0.80, 1.00, 1.20 mg·L-1

由图1可知,荧光体系中的最大共振光散射峰出现在308 nm处,且308 nm处的共振光散射强度随着半胱氨酸质量浓度的增加而逐渐减小,因此试验选择308 nm为检测波长。

2.2 缓冲溶液及其酸度、用量的选择

试验考察了分别以三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸、乙酸-乙酸钠、B-R等3种缓冲溶液作介质时对含1.00 mg·L-1半胱氨酸荧光体系ΔI的影响。结果显示,荧光体系的ΔI在B-R缓冲溶液中最大,因此试验选择B-R缓冲溶液进行共振散光射光谱测试。

试验进一步考察了B-R缓冲溶液酸度(pH 6.09,6.37, 6.59, 6.80, 7.00, 7.24)和其用量(0.25, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50 mL)对含1.00 mg·L-1半胱氨酸的荧光体系的ΔI的影响,结果见图2。

图2 B-R缓冲溶液酸度和用量对荧光体系ΔI的影响Fig.2 Effects of acidity and amount of B-R buffer solution on the ΔI of the fluorescence system

由图2可知,荧光体系的ΔI在B-R缓冲溶液的酸度为pH 6.59以及用量为0.75～1.00 mL时最大。因此,试验选择B-R缓冲溶液酸度为pH 6.59,用量为1.00 mL。

2.3 Fe(Ⅲ)溶液用量的选择

试验考察了Fe(Ⅲ)溶液用量分别为0.50, 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00 mL时对含1.00 mg·L-1半胱氨酸的荧光体系的ΔI的影响,结果见图3。

图3 Fe(Ⅲ)溶液用量对荧光体系ΔI的影响Fig.3 Effect of amount of Fe(III) solution on the ΔI of the fluorescence system

由图3可知,荧光体系的ΔI在Fe(Ⅲ)溶液用量为1.50 mL时最大,因此试验选择Fe(Ⅲ)溶液用量为1.50 mL。

2.4 邻菲啰啉溶液用量的选择

试验考察了邻菲啰啉溶液用量分别为0.50, 1.00, 1.50, 1.75, 2.00, 2.25, 2.50, 3.00 mL时对含1.00 mg·L-1半胱氨酸的荧光体系的ΔI的影响,结果见图4。

图4 邻菲啰啉溶液用量对荧光体系ΔI的影响Fig.4 Effect of amount of o-phenanthroline solution on the ΔI of the fluorescence system

由图4可知,荧光体系的ΔI在邻菲啰啉溶液用量为2.00 mL时最大,因此试验选择邻菲啰啉溶液用量为2.00 mL。

2.5 反应时间的选择

试验考察了反应时间为0～60 min时对含1.00 mg·L-1半胱氨酸的荧光体系的共振光散射强度的影响。结果显示,反应时间不小于10 min时,荧光体系的ΔI达到最大且在60 min内基本不变,说明本方法的稳定性较好。因此,试验选择反应时间为10 min。

2.6 标准曲线与检出限

分别取0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20 mL 10.0 mg·L-1半胱氨酸标准中间液于比色管中,按照试验方法测定, 以处理后荧光体系中半胱氨酸的质量浓度(0.20, 0.40, 0.60, 0.80, 1.00, 1.20 mg·L-1)为横坐标,其对应的ΔI为纵坐标绘制标准曲线。结果显示, 半胱氨酸的质量浓度在0.20～1.20 mg·L-1内和ΔI呈线性关系,线性回归方程为y=3 051x+64.13,相关系数为0.999 0。

按照试验方法平行测定试剂空白11次,以3倍I的标准偏差(s)与标准曲线斜率(k)的比值计算检出限(3s/k),结果为0.09 mg·L-1。

2.7 干扰试验

在分析含1.00 mg·L-1半胱氨酸的荧光体系时,考察了含半胱氨酸质量浓度500倍的胱氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酸、硬脂酸镁、淀粉、甘氨酸、桂皮酸、L-丙氨酸以及含其质量浓度1 000倍的山梨酸、葡萄糖等共存组分对半胱氨酸测定的影响。结果显示,在相对误差绝对值不超过5.0%条件下,共存组分对半胱氨酸的测定不造成干扰,可见本方法对半胱氨酸的选择性较好。

2.8 精密度和回收试验

按照试验方法重复分析含1.00 mg·L-1半胱氨酸的荧光体系10次,计算测定值的相对标准偏差(RSD)。结果显示:测定值的RSD为1.9%,说明仪器精密度较高。

按照试验方法分析2批实际样品,并进行两个浓度水平的加标回收试验,计算回收率和测定值的RSD,结果见表1。

表1 精密度和回收试验结果

由表1可知,不同批号半胱氨酸胶囊样品中半胱氨酸的测定值与标示值基本一致,回收率为97.8%～102%,测定值的RSD均小于3.0%,符合定量分析的要求。

本工作采用基于半胱氨酸-Fe(Ⅲ)-邻菲啰啉体系的共振光散射光谱法测定半胱氨酸的含量,方法操作简单、专属性强、精密度好、准确度高,可推广应用于食品及其他药物中半胱氨酸含量的测定。

致谢：感谢江苏省品牌专业二期工程(省特色专业-药物制剂,编号65);2021年江苏省首批一流本科课程(线下一流课程-药物分析,序号104);江苏海洋大学研究生科研与实践创新计划(KYCX2021-083)等项目对本工作的大力支持。