基于响应面法优化高效液相色谱法检测凉茶颗粒中7种绿原酸及其类似物的微波辅助萃取条件

陆剑华,陈其钊,王桂华,高裕锋,陈嘉敏,韩秋珍,黄可静,李颖茵

(广东省科学院生物与医学工程研究所(国家糖业质量检验检测中心),广州 510316)

绿原酸(CGA)是由咖啡酸与奎宁酸缩合成的酯,是植物体在有氧呼吸过程中经磷酸戊糖途径产生的一种苯丙素类化合物[1-2]。根据酯化位置和数目的不同,可将绿原酸及其类似物分为新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、洋蓟素、异绿原酸A、异绿原酸B和异绿原酸C等7种[2]。

绿原酸具有抗氧化、抗微生物、抗病毒、抗痉挛、降血糖、保护肝脏和神经等作用,是许多中成药的重要功效成分[3-4]。绿原酸的萃取工艺主要有水提醇沉法、加热回流法、超声法、酶法等,这些方法均存在萃取时间长、溶剂消耗大等缺点[5-9]。其他方法如超临界流体萃取法设备昂贵;微波辅助萃取技术具有耗时短、试剂耗费少,选择性、萃取率高,后处理方便,安全和环境友好等优点,且萃取过程中药粉不凝聚、不糊化[10],应用十分广泛[11-16],但在萃取中成药绿原酸中应用的报道较少。本工作通过单因素法和响应面法优化微波辅助萃取条件,并在优化的条件下萃取凉茶颗粒样品中绿原酸、新绿原酸、 隐绿原酸、洋蓟素、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C等7种绿原酸及其类似物,以高效液相色谱法(HPLC)同时测定,取得了满意结果。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1290型高效液相色谱仪;MDS-15型密闭式高通量微波消解/萃取工作站;KQ-500DE型超声波清洗机;VORTEX 3型涡旋混合器;CL5R型医用离心机;Milli-Q 型超纯水系统。

单标准储备溶液:1 000 mg·L-1,分别取适量绿原酸、新绿原酸、 隐绿原酸、洋蓟素、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C标准品,用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中,摇匀备用。

混合标准溶液系列:取适量单标准储备溶液,涡旋均匀后,用甲醇稀释,配制成各目标物质量浓度为0.01,0.05,0.1,0.5,1.0,2.0, 4.0 mg·L-1的混合标准溶液系列。

绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、洋蓟素、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C等标准品的纯度均不小于98%;甲醇、乙腈均为色谱纯;甲酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸均为分析纯;试验样品均采购于药店,样品信息见表1。

表1 样品信息

1.2 色谱条件

ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);柱温30 ℃;二极管阵列检测器;进样量10 μL;检测波长325 nm;流动相A为0.1%(体积分数,下同)磷酸溶液,B为甲醇;流量1.0 mL·min-1。梯度洗脱程序:0～2.00 min,A由90%降至85%;2.00～10.00 min,A由85%降至75%;10.00～20.00 min,A 由75%降至67%;20.00～27.00 min,A由 67%降至58%,保持13.00 min;40.00～40.01 min,A 由58%跳转至90%,保持4.99 min。

1.3 试验方法

取1.00 g凉茶颗粒样品,加入20 mL 70%(体积分数,下同)甲醇溶液,涡旋溶解1 min,置于微波萃取仪中,于80 ℃萃取 2.0 min。结束后摇匀,以0.22 μm滤膜过滤,滤液按照色谱条件测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 流动相

参照相关文献[17-27],考察了分别以0.5%(体积分数,下同)磷酸溶液-甲醇、0.1%磷酸溶液-甲醇、0.1%(体积分数,下同)乙酸溶液-甲醇、0.1%(体积分数,下同)甲酸溶液-甲醇、0.1%(体积分数,下同)三氟乙酸溶液-甲醇、0.1%三氟乙酸溶液-乙腈和0.1%三氟乙酸溶液-甲醇-乙腈这些体系作流动相时对7种目标物分离效果的影响。结果显示:以0.1%甲酸溶液作水相时,异绿原酸A和异绿原酸B色谱峰重叠;以0.1%乙酸溶液作水相时,7种目标物的色谱峰均拖尾;以甲醇作有机相时,7种目标物色谱峰没有重叠现象;乙腈洗脱能力比较强,作有机相时,异绿原酸A和洋蓟素色谱峰容易重叠;用0.1%磷酸溶液-甲醇、0.1%三氟乙酸溶液-甲醇体系进行洗脱时,洗脱效果均较好,且峰形对称。磷酸是实验室更常用的试剂,因此试验选择0.1%磷酸溶液-甲醇体系作流动相。进一步考察了磷酸体积分数分别为0.1%, 0.2%, 0.5%, 1.0%时对7种目标物分离效果的影响。结果显示,随着磷酸体积分数的增加,7种目标物的保留时间整体延长,但是其分离度、峰形以及响应值均变化不大。从保护色谱柱的角度出发,试验选择的流动相为0.1%磷酸溶液-甲醇体系。

2.1.2 色谱柱

试验比较了分别以ECOSILC18-eco 100A C18、Diamonsil Plus C18、Shim-pack VP-ODS C18、GL-InertSustain C18、ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱作固定相时7种目标物的分离效果,结果见图1。

图1 不同色谱柱分离情况考察Fig.1 Investigation of separation conditions on different chromatographic columns

由图1可知:以Diamonsil Plus C18色谱柱分离时,异绿原酸A和洋蓟素色谱峰出现重叠;以Shim-pack VP-ODS C18色谱柱分离时,异绿原酸A和洋蓟素色谱峰较宽,也出现重叠;以GL-InertSustain C18色谱柱分离时,异绿原酸B、异绿原酸A、洋蓟素和异绿原酸C的色谱峰形较差;以ZORBAX Eclipse Plus C18和ECOSIL C18-eco 100A C18色谱柱分离时,7种目标物能达到基线分离,且峰形对称。综合考虑,试验选择采用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱分离7种目标物。

2.1.3 柱温

柱温对7种目标物的分离效果影响较大[24],因此试验考察了柱温分别为25, 30, 35, 40 ℃时对7种目标物分离效果的影响。结果显示:柱温升高,7种目标物的保留时间整体缩短,分离度变化不大。从节省试验时间角度考虑,试验选择的柱温为30 ℃。

2.1.4 检测波长

用二极管阵列检测器进行全波长扫描,测得绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、洋蓟素、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C的最大吸光度对应波长均为325 nm,因此试验选择的检测波长为325 nm。

2.2 萃取方法的选择

分别采用微波辅助萃取法和超声萃取法萃取样品中的目标物。其中:进行超声萃取时,先准确取1.00 g凉茶颗粒样品,加入适量甲醇,涡旋溶解1 min,超声萃取30 min,用甲醇定容到25 mL,摇匀,过0.22 μm滤膜,滤液按照色谱条件测定。在10个实际样品中,罗浮山黑娃凉茶和金银花固体饮料中均未检出各目标物,其他样品中目标物的检出情况见表2。

表2 实际样品中7种目标物的测定值

由表2可知,微波辅助萃取法及超声萃取法测得的凉茶颗粒中7种目标物种类一致,微波辅助萃取法所得各目标物的含量整体高于超声萃取法的,说明微波辅助萃取法在凉茶颗粒的多指标成分质量评价中应用较优。因此,试验选择的萃取方法为微波辅助萃取法。

2.3 单因素试验

2.3.1 萃取溶剂的选择

试验考察了萃取溶剂甲醇溶液的体积分数分别为10%, 30%, 50%, 70%, 90%, 100%时对夏桑菊颗粒样品中7种目标物总峰面积的影响,结果见图2。

图2 甲醇溶液体积分数对7种目标物总峰面积的影响Fig.2 Effect of volume fraction of methanol solution onthe total peak area of 7 targets

由图2可知:当甲醇溶液体积分数从10%增至70%时,7种目标物的总峰面积逐渐增大,甲醇溶液体积分数为70%时总峰面积较大;甲醇溶液体积分数继续增加,7种目标物的总峰面积减小。综合考虑,试验选择甲醇溶液体积分数 50%, 70%, 90%进行响应面法试验。

2.3.2 萃取时间的选择

试验考察了萃取时间分别为1, 2, 3, 4, 5 min时对夏桑菊颗粒样品中7种目标物总峰面积的影响,结果见图3。

图3 萃取时间对7种目标物总峰面积的影响Fig.3 Effect of extraction time on the total peak area of 7 targets

由图3可知:萃取时间从1 min延长至2 min时,7种目标物总峰面积明显增大,2 min时总峰面积最大;萃取时间继续延长,总峰面积基本保持不变。综合考虑节约能源及萃取效率等因素,试验选择 1, 2, 3 min进行响应面法试验。

2.3.3 萃取温度的选择

试验考察了萃取温度分别为40, 50, 60, 70, 80 ℃时对夏桑菊颗粒样品中7种目标物总峰面积的影响,结果见图4。

图4 萃取温度对7种目标物总峰面积的影响Fig.4 Effect of extraction temperature on the total peak area of 7 targets

由图4可知:随着萃取温度的升高,7种目标物的总峰面积呈现先增大后减小的趋势;当萃取温度为70 ℃时总峰面积最大。推测:随着萃取温度的升高,分子热运动增强,样品与萃取溶剂的接触概率增加,但是过高的萃取温度会促进目标物氧化,导致总峰面积减小。综合考虑萃取效率等因素,试验选择萃取温度 60,70,80 ℃进行响应面法试验。

2.3.4 料液比的选择

试验考察了料液比[样品用量(g)…萃取溶剂体积(mL)]分别为1…5, 1…10, 1…15, 1…20, 1…30时对夏桑菊颗粒样品中7种目标物总峰面积的影响,结果见图5。

图5 料液比对7种目标物总峰面积的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on the total peak area of 7 targets

由图5可知:当料液比为1…5～1…30时,7种目标物的总峰面积随着料液比的减小而增大,当液料比为1…20时总峰面积较大。因此,试验选择 1…10, 1…20, 1…30进行响应面试验。

2.4 响应面试验

2.4.1 回归模型的建立与显著性检验

采用Box-Behnken中心组合设计,以7种目标物的总含量为响应值,2.3节优化所得的结果进行四因素三水平试验,响应面试验因素与水平见表3。其中:四因素分别为萃取溶剂甲醇溶液体积分数(A)、萃取时间(B)、萃取温度(C)、料液比(D),共进行29组试验;对中心点“0”水平重复试验5次,以计算回归模型误差。

表3 响应面试验因素与水平

Box-Behnken试验设计及结果见表4。

表4 Box-Behnken试验设计及结果

使用Design-Expert 13.0软件对表4数据进行拟合,所得回归模型为二次多项回归方程[公式(1)]。

Y=42.54-1.49A+0.433 1B+1.160C+

0.413 0D-3.210AB+2.070AC-

5.280AD+0.692 5BC-2.860BD-

2.100CD-7.680A2-5.690B2-

2.460C2-3.680D2

(1)

所得回归模型的显著性检验及方差分析结果见表5。其中:“*”表示P<0.05,差异显著;“**”表示P<0.01,差异极显著。

表5 回归模型的显著性检验及方差分析结果

由表5可知:所建回归模型的P值为0.0148,小于0.05,表明所建回归模型对所有变量的分析具有显著意义,响应面试验设计可靠;回归模型的失拟项P值为0.383 9,大于0.05,说明该回归模型拟合较好;A2,B2对7种目标物总含量的影响极显著,AD,D2的影响显著;以F值评价各因素对凉茶颗粒中7种目标物总含量的影响,影响由大到小分别为A,C,B,D,交互因素由大到小分别为AD,AB,BD,AC,CD,BC。

2.4.2 各因素交互作用的响应面分析

以响应面和等高线(响应曲面的投影)形状来判断两因素的交互程度[28],结果见图6。

图6 因素交互作用对7种目标物总含量影响的响应面图Fig.6 Response surface diagrams of the effect of factor interaction on total content of 7 targets

由图6可知:各因素的交互作用的等高线中,AD、AB的等高线偏椭圆形,AD的更显著;AD的响应面较其他响应曲更陡峭,AB次之。以上结果说明,AD、AB的交互作用较强,这与方差分析结果一致。

2.4.3 最优萃取条件的预测和试验验证

采用 Design-Expert 13软件优化回归模型,所得最优萃取条件为甲醇溶液体积分数71.06%, 萃取时间1.874 min, 萃取温度79.672 ℃, 料液比 1…16.443,该条件下7种目标物的总测定值为41.10 mg·kg-1。综合考虑实际情况和可操作性,将7种目标物的最优萃取条件设定为甲醇溶液体积分数70%, 萃取时间2.0 min, 萃取温度80 ℃,料液比 1…20,在该条件下进行5次平行试验,得到7种目标物的总测定值为32.98 mg·kg-1,是预测值的80.3%,进一步证明了该模型有一定的可靠性。

2.5 方法学考察

2.5.1 标准曲线、检出限和测定下限

按照仪器工作条件测定混合标准溶液系列,以7种目标物的质量浓度为横坐标,其对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。结果显示,7种目标物的质量浓度均在0.01～4.0 mg·L-1内和峰面积呈线性关系,其他线性参数见表6。

表6 线性参数、检出限和测定下限

分别以3, 10倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N)和测定下限(10S/N),结果见表6。

2.5.2 精密度和回收试验

按照试验方法对空白样品(谷芽配方颗粒)进行低、中、高等3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平进行6次平行测定,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表7。

表7 精密度和回收试验结果 (n=6)

由表7可知,7种目标物的回收率为97.5%～105%,测定值的RSD为1.4%～6.9%,说明本方法具有较好的准确度和精密度。

本工作以凉茶颗粒为研究对象,以微波辅助萃取-HPLC测定凉茶颗粒中7种绿原酸及其类似物的含量,方法快速、可靠、准确、简便,且溶剂用量少,可为中成药中绿原酸质量监控提供参考方法。