猪睾丸Dickkopf样顶体蛋白1基因的转录调控分析

许 静, 代红梅, 张 霞, 刘志朋, 杨 忠, 李卫真, 付仕颖, 克比努尔·库尔班, 霍金龙

(1.云南农业大学动物科学技术学院,云南 昆明 650201;2.吕梁学院生命科学系,山西 吕梁 033001;3.云南生物制药有限公司,云南 昆明 650503;4.云南农业大学动物医学院,云南 昆明 650201)

Dickkopf样顶体蛋白1(acrosomal protein Dickkopf-like 1, DKKL1)是一种在动物睾丸精母细胞中特异性表达的蛋白,对精子发生至关重要[1]。DKKL1与DKK基因家族成员DKK3的离散区域部分同源,与别的DKK基因家族成员不同源[2]。DKKL1仅存在于哺乳动物中,并且在各物种之间高度保守[3]。研究表明:小鼠DKKL1最早在胚胎和未成熟的神经组织中表达,胚胎发育15 d后在骨骼和眼睛中表达[1];小鼠成年后,DKKL1主要在睾丸精母细胞中高度表达并定位于成熟精子的顶体,获能后的DKKL1主要迁移到精子表面参与受精[3-4],随后当精母细胞逐渐形成精子时,DKKL1在精子新生顶体中发挥作用[5]。DKKL1存在于精细胞未成熟的顶体以及成熟精子的顶体中,在小鼠精母细胞发育和成熟中发挥作用[6];此外,DKKL1通过抑制发育中的精子细胞的运动,从而防止其过早迁移到生精小管的管腔后被排出体外[6]。DKKL1在促进精子有效穿过透明带、滋养细胞降解透明带以及辅助胚胎植入子宫内膜等方面发挥了重要作用[6-7]。虽然缺乏DKKL1的胚胎可在体内发育成正常小鼠[7-8],但在体外缺乏DKKL1的精子使卵子的受精能力严重减弱,因此,DKKL1对雄性的体外生育能力十分重要[7]。DKKL1还是成年雄性动物精母细胞凋亡的关键调节因子,可限制精子的产生,而在老年雄性动物的睾丸中,DKKL1负责调控睾丸间质细胞中类固醇生成因子SF-1的功能,使类固醇生成酶基因表达下调,从而导致睾酮合成量减少,因此,DKKL1被认为是雄性成年动物睾丸生理学的双重调节因子[1]。然而,无论DKKL1的作用方式如何,在缺少DKKL1的动物中观察到精子数量增加,表明调节其表达或活性可影响雄性生育能力。在某些人类少精子症病例中,阻断DKKL1活性有助于增加精子数量[1];此外,DKKL1还与表皮角质形成[9]、阿尔茨海默症[10]、乳腺癌[11]等发展进程有关。

版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line, BMI)作为我国自主繁育的大型哺乳动物近交群体,是良好的试验动物模型,在生物医学等领域具有重要研究价值[12]。近年来,繁殖力限制了BMI群体的应用与发展,研究影响精子发生基因的功能对提高BMI公猪的繁育能力至关重要。据此,本研究以BMI睾丸为试验对象,进行全转录组测序并分析DKKL1的表达量,克隆DKKL1编码区并分析基因结构和蛋白质功能,挖掘DKKL1的互作蛋白,注释DKKL1功能并构建DKKL1的竞争性内源RNA(competitive endogenous RNA, ceRNA)转录调控网络。结果不仅为深入研究DKKL1在BMI睾丸中的作用机制提供依据,而且对研究人体和其他哺乳动物中DKKL1的功能也具有参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验动物

供试的4头12月龄BMI成年公猪来自昆明原种猪场。

1.2 转录组测序及DKKL1表达量的获得

4头BMI公猪去势后取其睾丸组织,提取RNA并构建文库,分别使用Illumina Hiseq 4000和Illumina novaseq 6000平台进行RNA-seq和核仁小RNA(small nucleolar RNA, snoRNA)测序。使用Fastp软件对原始RNA-seq数据进行质量控制,使用Bowtie 2-2.1.0软件去除rRNA序列,使用STAR-2.5.2a软件与猪参考基因组(Susscrofa11.1)进行比对,使用featureCounts-2.0.1软件和Salmon-1.5.1软件获得DKKL1的表达量。对于snoRNA,使用Bowtie 2-2.1.0软件将rRNA、tRNA、snRNA和snoRNA去除,将剩余质控后的序列与miRBase数据库中所有物种的微小RNA(micro RNA, miRNA)序列进行比对,获得BMI睾丸miRNA的表达量。

1.3 基因扩增及序列测定

通过分析转录组测序数据,获得BMIDKKL1转录本对应Ensembl数据库中的转录本序号为ENSSSCT00000058631.2,设计特异性引物(上游引物序列:CGCCCCAGGTAATCCGGCCTA;下游引物序列:GTGTTCCGCTGTCCTCGCTC),扩增DKKL1编码区序列。PCR总体积为25 μL:含12.5 μL PremixTaqTM(v2.0),10 μmol·L-1上、下游引物各1 μL,1 μL 25 ng·μL-1cDNA,用H2O补足体系。运行程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 2 min,30个循环;72 ℃ 5 min。由昆明擎科生物公司测序PCR产物获得DKKL1序列。

1.4 DKKL1功能分析

使用Lasergene 7.1软件校对经Sanger软件测序后的DKKL1序列;DKKL1的开放阅读框(ORF)使用NCBI的ORF Finder软件进行分析;通过ExPASy网站对DKKL1性质进行分析;通过SOPMA网站、ProtScale网站、TMHMM 2.0网站分别预测DKKL1的二级结构、疏水性结构和跨膜结构;通过SignalP 5.0网站、NetPhos 3.1网站、NCBI BLAST网站分别预测DKKL1的信号肽、磷酸化位点和保守结构域。在Ensembl数据库下载12个猪品种(杜洛克、长白、大白、巴克夏、汉普夏、皮特兰、梅山、八眉、金华、五指山、藏猪、荣昌)DKKL1编码区序列并与BMIDKKL1转录本序列进行比对,检测是否存在单核苷酸多态性变异位点。使用MEGA-X软件构建DKKL1系统发育树并使用Adobe Illustrator 2022软件进行美化,使用Megalign软件对多物种序列进行相似性分析,并使用R软件中的ggplot2包进行可视化。

1.5 DKKL1蛋白互作分析

使用String v11.0b软件进行蛋白互作分析,并使用Cytoscape软件进行可视化,然后使用软件中的clusterProfiler包对这些蛋白进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)和基因本体(gene ontology, GO)富集分析并用ggplot2包进行可视化。通过睾丸转录组测序数据分析DKKL1表达量与这些蛋白编码基因表达量之间的相关性并用R软件中的circlize包进行可视化。

1.6 DKKL1功能注释及ceRNA转录调控网络的构建

通过UniProt数据库对DKKL1进行GO功能注释,通过全转录组数据分析miRNA和长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)的表达量,通过miRanda 3.3网站和RNAhybrid 2.1.2网站获取调控DKKL1的miRNA和lncRNA,并用Cytoscape 3.9.1软件进行可视化。

2 结果与分析

2.1 DKKL1的表达量及特征信息

转录组测序获得BMI的DKKL1均具有较高的正表达量,平均表达量为16 112.33,进一步通过矫正获得的平均每百万映射读取的转录本(TPM)为881.16(图1A)。比对发现,BMI中高表达的DKKL1与Ensemble网站中的ENSSSCT00000058631.2相对应,位于猪(Susscrofa11.1)第6号染色体4 142 467～4 147 022 bp处,含有5个外显子和4个内含子(图1A)。RT-PCR检测获得DKKL1产物的长度为887 bp(图1B),编码区全长702 bp(图1C),包含233个氨基酸(图1D)。基因和蛋白序列提交至GenBank获得的登录号分别为OL362243和UZD11050。

2.2 DKKL1的序列及结构

BMI DKKL1分子质量为26.591 ku,分子式为C1177H1871N349O347S4,等电点8.07,正电荷残基总数33个,负电荷残基总数32个。在DKKL1的二级结构中,无规则卷曲的比例最大,其次是α-螺旋和延伸链,只含有少量β-转角(图2A)。DKKL1的N端疏水,C端亲水;疏水性最大值为2.733,位于第9个氨基酸处;疏水性最小值为-3.689,位于第81个氨基酸处(图2B)。DKKL1含有丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点(图2C)。DKKL1含有信号肽(图2D),切割位点在第21与22位氨基酸之间。

2.3 DKKL1的保守性及系统进化关系

系统进化分析表明,BMI与山羊(XP_005692770)、绵羊(XP_042088245)、麋鹿(XP_043292184)、白尾鹿(XP_020741201)的亲缘关系较近(图3A);相似性分析表明,BMIDKKL1编码区对应的氨基酸序列与除了食蟹猕猴(XP_005589936)和黑猩猩(XP_016792018)以外的其他哺乳动物的相似度均在80%以上(图3B);BMIDKKL1编码区高度保守,与杜洛克、长白、大白、巴克夏、汉普夏、皮特兰、梅山、八眉、金华、五指山、藏猪、荣昌等12个猪品种比对不存在单核苷酸多态性。综上所述,BMI DKKL1在进化过程中与其他哺乳动物之间具有较高的保守性以及序列同源性。

A:系统进化树;B:相似性。

2.4 DKKL1与互作蛋白的关系

蛋白互作分析表明,DKKL1与多种蛋白存在互作关系(图4A),互作密切程度从高到低依次为含螺旋结构域的蛋白155(coiled-coil domain containing protein 155, CCDC155)、转录增强缔合域蛋白2(transcriptional enhanced association domain protein-2, TEAD2)、RAS癌基因家族成员11B(member of RAS oncogene family 11B, RAB11B)、癌症相关基因-1(cancer-associated gene-1, CAGE1)、Dickkopf相关蛋白4(Dickkopf-related protein 4, DKK4)、WNT家族成员2B(WNT family member 2B, WNT2B)、胞质非特异性二肽酶2(cytosolic non specific dipeptidase 2, CNDP2)、二酰基甘油脂肪酶(diacylglycerol lipase alpha, DAGLA)等。将这些蛋白进行KEGG富集分析并取P<0.05的前20个通路,发现这些蛋白主要富集在Wnt信号、阿尔茨海默症、乳腺癌、胃癌、mTOR信号、Hippo信号、肝细胞癌等通路上(图4B);GO富集分析发现,这些蛋白主要富集在典型Wnt信号通路、细胞-细胞黏附调控、脂肪细胞分化调控、信号受体活性调节、共受体结合等条目上(图4C)。通过转录组测序数据分析DKKL1与这些蛋白编码基因表达量之间的相关性,结果(图4D)显示,DKKL1表达量与TEAD2、CNDP2的表达量显著相关(P<0.05)。

A:互作蛋白网络;B:互作蛋白KEGG富集分析图;C:互作蛋白GO富集分析图;D:互作蛋白编码基因表达量的相关性弦图。

2.5 DKKL1功能注释及ceRNA转录调控网络

DKKL1功能注释结果显示共有13个GO。其中:生物过程主要包括信号受体活性的负向调控、脂肪细胞分化的正向调控、睾酮生物合成过程的负向调控、解剖结构形态发生、典型Wnt信号通路的负向调控、透明带穿透、凋亡过程的正向调控等7个方面;细胞组分主要包括顶体泡、胞质囊泡、细胞外区域、细胞外空间等4个方面;分子功能主要包括受体结合、受体拮抗剂活性调节等2个方面(图5)。

ceRNA转录调控网络分析发现,BMIDKKL1受miR-15a和miR-15b两个miRNA靶向调控,另有8个lncRNA(ENSSSCG00000043931.1、ENSSSCG00000037771.2、ENSSSCG00000049125.1、ENSSSCG00000045328.1、ENSSSCG00000050726.1、ENSSSCG00000044738.1、ENSSSCG00000031683.2、ENSSSCG00000050821.1)与DKKL1竞争性结合miR-15a,有2个lncRNA(ENSSSCG00000041693.1、ENSSSCG00000043136.1)与DKKL1竞争性结合miR-15b(图5)。

3 讨论与结论

本研究通过全转录组测序获得了BMI睾丸DKKL1的表达量,比对发现BMI中高表达的DKKL1与Ensemble数据库中的ENSSSCT00000058631.2相对应;采用cDNA扩增了DKKL1编码区序列,GenBank认证的基因登录号为OL362243,蛋白登录号为UZD11050;BMI在进化上与绵羊、山羊、麋鹿、白尾鹿等偶蹄目动物的亲缘关系较近;BMIDKKL1编码区对应的氨基酸序列与除了食蟹猕猴和黑猩猩以外的其他哺乳动物的相似度均大于80%,表明BMI DKKL1在进化过程中与其他哺乳动物之间具有较高的保守性和序列同源性。

功能分析表明:DKKL1含有信号肽,但不含保守结构域;含有丝氨酸和苏氨酸磷酸化位点,这两种氨基酸是激酶作用的靶点,在脊椎动物的精子发生中起重要作用[13]。DKKL1是一种糖基化蛋白,糖基化在精子发育和精卵结合中起着重要作用[14]。在精子发生过程中,DKKL1经历了N-连接糖基化,而在成熟精子中以非N-糖基化方式被修饰。DKKL1作为一种新的顶体蛋白可能参与顶体组装,并在精子发生过程中促进顶体的形成从而发挥作用[6]。

蛋白互作网络分析发现,DKKL1与CCDC155、TEAD2、RAB11B、CAGE1、DKK4、WNT2B、CNDP2、DAGLA等多个蛋白互作,其中与CCDC155互作最为密切。CCDC155(KASH5)作为细胞质动力蛋白的外核膜适配器主要存在于哺乳动物的睾丸和卵巢中[15];小鼠睾丸中的CCDC155仅在初级精母细胞中表达,对减数分裂前期调节端粒主导的染色体运动至关重要,CCDC155缺失的小鼠患无精子症从而不育[16]。TEAD2位于DKKL1下游3.8 kb处,二者转录方向相反,在哺乳动物发育初期同时表达,并在胚胎发育时期细胞分化开始时差异表达[17];TEAD2在正常小鼠睾丸支持细胞和睾丸间质细胞中表达,与精子发生和精子成熟有关[17];转录组测序数据分析表明,TEAD2表达量与DKKL1表达量显著相关,为下一步开展TEAD2研究指明了方向。RAB11B是RAB11亚家族成员,是一种在哺乳动物睾丸中高度表达的YPT/RAB蛋白[18];RAB11在成年果蝇的睾丸和卵巢中表达,对生育至关重要;RAB11的突变会破坏肌动蛋白细胞骨架,导致精子缺陷以及卵母细胞减少[19]。CAGE1主要在小鼠精子成熟后表达,是哺乳动物精子细胞和顶体的重要组成成分,对成功受精至关重要[20]。DKK4与精子发生有关,在减数分裂过程中精母细胞、精子细胞和精子所在的血睾屏障腔室中可阻断Wnt信号通路的激活,从而影响未分化精原细胞的增殖[21]。WNT2B在初生小鼠睾丸中表达,与精原干细胞(SSC)活性和精子发生有关[22],在人类减数分裂中也具有重要作用,其受体仅在初级精母细胞中表达[23]。CNDP2是一种精浆蛋白,与无精子症有关[24];转录组测序数据分析表明,CNDP2表达量与DKKL1表达量显著相关,为拓展DKKL1的研究提供了方向。DAGLA主要存在于睾丸间质细胞中,与精子发生相关[25]。对互作蛋白进行GO和KEGG富集分析发现,这些蛋白主要富集在典型Wnt信号通路、细胞-细胞黏附调控、信号受体活性调节等条目上,为深入研究DKKL1在BMI中的功能提供了参考。

本研究对DKKL1进行功能注释发现,其主要参与睾酮生物合成过程的负向调控、透明带穿透、顶体泡生成、凋亡过程的正向调控等。靶基因分析发现,有2个miRNA(miR-15a、miR-15b)可在精子发生中靶向下调DKKL1 mRNA的表达,从而抑制DKKL1的表达[26-27]。miR-15a在小鼠减数分裂前持续下降,对早期精子发生至关重要[28];miR-15a在公牛精子中表达,并与公牛生育力呈负相关,低生育率公牛中的miR-15a水平比高生育率公牛高[29];降低人体精索静脉曲张中miR-15a的表达可保护精子免受高温或氧化应激损伤,从而避免不育[30]。miR-15b对精子发生至关重要,其异常高表达可能会破坏体内正常精子的发生[31];miR-15b与精子结构、运动和代谢相关蛋白质有关[32];另外,miR-15b可靶向大鼠Bcl-2和半胱天冬酶信号通路在细胞凋亡过程中发挥作用[33]。本研究中,miR-15a和miR-15b的发现为DKKL1的深入研究提供了方向。

综上所述,本研究采用全转录测序方法获得了BMI睾丸组织中DKKL1的表达量,通过RT-PCR获得了DKKL1编码区序列并分析了基因结构和蛋白质功能,构建了蛋白质互作网络并对这些蛋白进行了GO和KEGG富集分析,注释了DKKL1功能并构建了ceRNA转录调控网络。本研究结果不仅为深入研究DKKL1在BMI睾丸中的作用机制提供了依据,也为DKKL1在人体或其他哺乳动物中的功能及转录调控机制研究提供了参考。