大黄素联合5AzA-cdR增强对胰腺癌细胞ppENK抑癌基因的去甲基化作用研究

陈亮 唐坚 褚永权 叶剑宏 沈超 钱晓宇 姚旭枫

胰腺癌其临床表现隐匿，早期诊断困难，容易发生远处转移，是预后很差的消化系统恶性肿瘤之一，总体五年生存率为10%左右[1]。尽管手术切除是唯一可能的治愈手段，但由于胰腺癌早期症状不典型、易发生转移等特点，大部分患者就诊时已无法根治性切除[2,3]。基因的异常甲基化是肿瘤发病的重要原因之一，抑癌基因的高甲基化会导致转录抑制甚至丢失，从而导致异常分化、增殖、癌变[4]。5-氮-2′脱氧胞苷（5-AzA-2′-deoxycytidine，5AzA-cdR）是目前最常用的去甲基化核苷类似物之一[7]。本次研究旨在研究大黄素联合5AzA-cdR用药对胰腺癌抑癌基因ppENK的去甲基化作用。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料 研究时间为2022 年1 月至2022年12 月，本次研究在嘉兴市第一医院中心实验室完成，人胰腺癌细胞株Panc1 由本次研究组引进并保存。

1.2 方法

1.2.1 细胞系和培养 将人胰腺癌细胞株Panc1置于胎牛血清中，在100 U/mL链霉素和青霉素DMEM培养基，37 ℃、饱和湿度、5% CO2下培养，2～4 d换液一次，待细胞生长至70%～80%时传代培养，取其对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 细胞计数实验（cell counting kit-8，CCK-8）取对数生长期的Panc1 细胞于96 孔板中，每孔接种5×103/100 μL 细胞，分别使用浓度为0、10、20、40、80 μmol/L 的大黄素处理细胞24 h、48 h 和72 h，每组同时设6 个副孔。细胞培养结束后，每孔加入10 μL 的CCK-8 继续培养1～2 h，用酶标仪测定各孔在450 nm 波长下的光密度（optical density，OD），实验重复3 次。并计算细胞抑制率，从而选出最适大黄素浓度。

细胞抑制率=（1-实验组OD 值/对照组OD值）×100%

1.2.3 实验分组 将培养后的Panc1 细胞分为四组接受不同的处理：对照组、最适大黄素浓度组（40 μmol/L）、5AzA-cdR 组（1 μmol/L）和大黄素（40 μmol/L）联合5AzA-cdR（1 μmol/L）用药组。

1.2.4 Dot-blot 实验 四组作用于Panc1 细胞72 h后，用细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒（由上海杰瑞生物工程有限公司生产）按照说明提取各组DNA，使用HS dsDNA Kit 和Qubit Fluormeter（Invitrogen）通过荧光测定术来测定DNA 的浓度。四组DNA 打在尼龙膜上（Hybond-N+，GE），置于紫外发光仪器中5 min，随后5%脱脂牛奶封闭1.5 h，洗涤5 min，3 次，一抗（anti-5mc）4 ℃孵育过夜，一抗孵育结束后二抗室温孵育1 h，洗涤后ECL发光上机检测，打点的灰度值通过Image-J软件分析。

1.2.5 亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR，BSP）使用细胞/组织基因组DNA 提取试剂盒，按照说明书提取四组DNA，取1 μg DNA进行亚硫酸盐修饰，反应体系结束后，取10 μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳45 min，电泳结束后拍UV照片，检查BSP 反应产物，反应产物回收，送上海麦普生物技术有限公司进行克隆，随机选取10 个克隆进行测序，使用BiQ Analyzer 软件分析样本的甲基化状态。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用F检验和LSD-t检验。设P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同大黄素浓度对Panc1细胞生长抑制作用见表1

表1 不同大黄素浓度对Panc1细胞的生长抑制率比较

由表1 可见，大黄素以时间梯度和浓度梯度抑制胰腺癌细胞Panc1生长，40 μ mol/L浓度作用72 h后细胞生长抑制率接近半数抑制率。

2.2 四组5 mc水平和ppENK甲基化率比较见表2

表2 四组5 mc水平和ppENK甲基化率比较

由表2可见，四组的5 mc水平和ppENK甲基化率比较，差异均有统计学意义（F分别=69.86、785.14，P均＜0.05）。Dot-blot 实验显示，最适大黄素浓度组和5AzA-cdR 组5 mc 水平低于对照组，差异均有统计学意义（t分别=12.55、20.12，P均＜0.05），5AzA-cdR 组相对5 mc 水平较最适大黄素浓度组下降明显，差异有统计学意义（t=17.76，P＜0.05），大黄素联合5AzA-cdR 用药组5 mc的水平较对照组、最适大黄素浓度组以及5AzA-cdR 组明显下降，差异有统计学意义（t分别=30.22、20.77、10.45，P均＜0.05）。BSP 结果显示，最适大黄素浓度组和5AzA-cdR 组ppENK 甲基化率均低于对照组，差异均有统计学意义（t分别=14.27、21.34，P均＜0.05），5AzA-cdR 组ppENK 甲基化率较最适大黄素浓度组下降明显，差异有统计学意义（t=16.41，P＜0.05），大黄素联合5AzA-cdR 用药组ppENK 甲基化率较对照组、最适大黄素浓度组以及5AzA-cdR组明显下降，差异均有统计学意义（t分别=32.68、19.33、10.12，P均＜0.05）。

3 讨论

近年来，胰腺癌的发病率逐年上升。大多数患者确诊时已经发生转移，失去了根治性手术机会，预后很差。虽然近年来临床使用吉西他滨已将晚期胰腺癌患者的1 年生存率提高约20%，但并未取得明显改善。越来越多的证据表明，许多肿瘤它从表观遗传变化和基因突变开始，并启动肿瘤促进过程。表观遗传变化是基因表型的变化，它是不改变基因的DNA 序列的变化。DNA 甲基化是基因表观遗传修饰的重要手段之一，DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化，以S-腺苷甲硫氨酸提供甲基供体的形式催化，其不改变DNA序列和遗传密码，将甲基转移到特定的碱基上，并且是可逆的。

Ueki等[5]报告ppENK基因含有42 个CpG岛，其中有7 个CpG 岛在胰腺癌细胞系中的甲基化率为93%，而在正常胰腺组织中则没有甲基化，表明ppENK以及转录抑制是胰腺癌发生中的常见事件。Fukushima等[6]报道了15 例浸润性导管腺癌中14 例的ppENK 甲基化，但非肿瘤胰腺上皮没有甲基化。目前最常用的去甲基化药物主要有阿扎胞苷和地西他滨两种核苷类似物[7]，5AzA-cdR 是目前应用最广泛的去甲基化核苷类似物之一，主要通过在低浓度下抑制DNMT 的表达和活性发挥去甲基化作用，但其毒副作用较大，最明显的是药物毒性和骨髓抑制，限制了其在肿瘤方面的临床应用。因此，开发具有去甲基化作用、毒副作用小的药物具有重大意义。

根据课题组前期研究，已知大黄素对胰腺癌细胞Panc1 具有一定程度的去甲基化作用，但大黄素的去甲基化强度较5AzA-cdR弱。目前治疗肿瘤多为联合用药，基于此本课题组提出大胆设想，大黄素联合5AzA-cdR作用于胰腺癌细胞时会不会比两种药物单独作用更强？本次研究根据CCK-8 实验结果选择了大黄素浓度为40 μmol/L 进行进一步实验。Dot-blot 结果表明，40 μmol/L 大黄素组和5AzA-cdR 组与对照组比较可以降低基因组相对5 mc 的表达，40 μmol/L 大黄素组的作用强度要弱于5AzA-cdR 组，特别当40 μmol/L 大黄素与5AzAcdR联合使用时，5mc的水平显著降低，这充分说明40 μmol/L 大黄素可以增加5AzA-cdR 对胰腺癌细胞的去甲基化作用。为了进一步验证去甲基化作用，本次研究BSP 结果显示对照组、大黄素组、5AzA-cdR 组、大黄素联合5AzA-cdR 用药组处理Panc1 细胞72 h 后，ppENK 基因的甲基化率逐渐下降，可见大黄素联合5AzA-cdR 用药可以明显增加其对抑癌基因ppENK 的去甲基化作用。在生物体内，催化甲基化反应的主要是甲基转移酶（DNMT1、DNMT3a、DNMT3b），使抑癌基因发生去甲基化的途径主要有抑制甲基转移酶的活性和减少甲基转移酶的表达两种方式，其是否可以抑制甲基转移酶的活性和表达，还有待于后期研究。

综上所述，40 μmol/L 大黄素联合5AzA-cdR 药物可以降低5 mc 的基因组水平，可以对Panc1 抑癌基因ppENK发挥明显的去甲基化作用，且作用强度要比两药的单一用药强，这一发现为胰腺癌的临床治疗机制提供了新思路，而表观遗传学中的联合用药去甲基化作用也是其发挥作用的重要机制。