松萝酸通过调节SphK1/S1P信号通路减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤

胡丹阳 王燕

缺血性心脏病是造成患者死亡的主要原因[1]。目前的治疗手段易引发心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI），如何改善缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）引起的心肌损伤是临床治疗中关注的重点[2]。研究发现β-环糊精（β-cyclodextrin，βCD）/松萝酸（usnic acid，UA）包合物能够保护大鼠心脏免受H/R 损伤[3]。抑制鞘氨醇激酶1（sphingosine kinase 1，SphK1）/鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）通路可改善脑缺血预后[4]。UA对H/R诱导的心肌细胞损伤的作用尚未明晰，本研究旨在探究UA 对H/R 损伤的作用及SphK1/S1P信号的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 大鼠H9c2 心肌细胞（SNL-029）购自尚恩生物公司；UA（纯度98%，DS0044）由德思特生物公司生产；Benzyl butyl phthalate（BBP，HY-W011338）由美国MCE 公司生产；DMEM 培养基、磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）、MTT 试剂、凋亡检测试剂盒、4%多聚甲醛均由南京森贝伽生物公司生产；裂解液、ATP 检测试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、化学发光液、羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗均由碧云天生物公司生产；PVDF膜，白介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、ELISA 试剂盒均由美国Thermo 公司生产；一抗SphK1（ab302714）、鞘氨醇-1-磷酸受体1（sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1PR1，ab259902）、细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2，ab184699）均由美国Abcam 公司生产；电泳仪、转膜仪均由美国Bio-Rad 公司生产；流式细胞仪由美国BD公司生产；Tanon 1600凝胶成像仪由天能集团公司生产。

1.2 方法

1.2.1 H/R模型制备及UA浓度筛选 复苏H9c2细胞，使用DMEM 培养基培养，待细胞生长状态稳定后接种于96 孔板中，在无菌环境下培养24 h 后，转移至94%N2、5%CO2、1%O2环境下培养4 h，再转移至5%CO2、21%O2环境下培养6 h，制备H/R H9c2细胞模型[5]。使用0、0.5、1、4、16、64 μmol/L UA 分别预处理H9c2 细胞24 h，再进行缺氧复氧处理，按照MTT 试剂盒操作要求测定各组细胞光密度（optical density，OD）值。

1.2.2 分组处理 将H9c2细胞和H/R模型H9c2细胞分别种于24 孔板中培养24 h，H9c2 细胞作为对照组，H/R模型H9c2细胞随机分为模型组、UA低剂量组、UA中剂量组、UA高剂量组和UA高剂量+BBP组。对照组和模型组不做处理，UA低、中、高剂量组分别以1、4、16 μmol/L UA 处理，UA高剂量+BBP组以16 μmol/L UA 和100 nmol/L BBP 处理[6]，处理时间为24 h。

1.2.3 检测细胞增殖活力 将处理好的六组细胞接种在24 孔板中培养12 h，然后换用Edu 培养基（50 μmol/L）孵育2 h，多聚甲醛固定0.5 h，加入200 μL 甘氨酸孵育5 min，在先后加入0.5% Triton X-100 和Apollo 染液孵育0.5 h，最后加入DAPI 核染液，荧光显微镜下观察并统计Edu阳性率。

1.2.4 检测细胞凋亡状况 将处理好的六组细胞重悬，取1.0×105个细胞洗涤后进行FITC/PI 双染，使用流式细胞仪评价细胞凋亡情况。

1.2.5 检测炎症因子IL-1β、IL-6 和氧化应激因子MDA、SOD 的含量 收集六组细胞上清液，按照说明书要求使用ELISA 试剂盒检测上清液中IL-1β、IL-6、MDA、SOD的含量。

1.2.6 检测ATP 含量 取处理好的六组细胞，在4 ℃下裂解，12 000 r/min 离心，按照化学发光法试剂盒操作要求检测上清液中ATP的含量。

1.2.7 Western blot 检测各组细胞SphK1、S1PR1、ERK1/2蛋白表达水平 裂解处理好的六组细胞，定量蛋白浓度。制作SDS-PAGE 凝胶，并在上样处分别点样，经过1.5 h电泳和2 h转膜后，样品条带转移至PVDF 膜，室温下使用胎牛血清封闭PVDF 膜，随后转至SphK1、S1PR1、ERK1/2抗体稀释液（1∶1000）中4 ℃过夜，再转入二抗稀释液（1∶1000）室温孵育1 h，PBS 洗去膜上抗体，滴加发光液，使用Tanon 1600 分析蛋白表达水平。

1.3 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0.2 分析数据，以均数±标准差（±s）表示，组间差异使用单因素方差分析，组间两两比较使用LSD-t检验。设P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度UA 对H/R 模型H9c2 细胞增殖活力的影响 0、1、4、16、64 μmol/L UA 处理H/R 模型H9c2 细胞后OD 值分别为0.48±0.04、0.62±0.07、0.68±0.08、0.80±0.09、0.90±0.10。与0 μmol/L UA组相比，1、4、16、64 μmol/L UA 处理H/R 模型H9c2 细胞后，细胞增殖活力显著升高（t分别=4.25、5.48、7.96、9.55，P均＜0.05）。

2.2 各组细胞增殖活力比较见图1

图1 各组细胞增殖活力

由图1可见，与对照组相比，模型组细胞增殖活力下降；与模型组相比，UA 低、中、高剂量组细胞增殖活力提高，且呈剂量依赖性；与UA高剂量组相比，UA高剂量+BBP组细胞增殖活力下降。

2.3 各组细胞凋亡情况比较见图2

图2 流式细胞法检测各组细胞凋亡情况

由图2可见，与对照组相比，模型组细胞凋亡率增加；与模型组相比，UA 低、中、高剂量组细胞凋亡率下降，且呈剂量依赖性下降；与UA高剂量组相比，UA高剂量+BBP组细胞凋亡率增加。

2.4 各组细胞IL-1β、IL-6、MDA、SOD的含量见表1

表1 各组细胞上清液中IL-1β、IL-6、MDA、SOD的含量比较

由表1可见，六组IL-1β、IL-6、MDA、SOD比较，差异均有统计学意义（F分别=65.24、36.32、89.25、40.57，P均＜0.05）。与对照组相比，模型组细胞IL-1β、IL-6、MDA含量增加，SOD含量降低（t分别=13.58、9.40、14.28、-11.37，P均＜0.05）；与模型组相比，UA低、中、高剂量组细胞IL-1β、IL-6、MDA含量降低，SOD 含量上升（t分别=-4.07、-2.84、-4.05、4.29；-8.18、-6.04、-10.16、7.76；-11.88、-9.05、-14.45、9.53，P均＜0.05）；与UA高剂量组相比，UA高剂量+BBP 组细胞IL-1β、IL-6、MDA 含量增加，SOD含量降低（t分别=10.94、7.92、11.30、-7.59，P均＜0.05）。

2.5 各组细胞上清液中ATP含量比较 对照组、模型组、UA 低剂量组、UA 中剂量组、UA 高剂量组、UA 高剂量+BBP 组的ATP 含量分 别为（24.87±2.56）nmol·mg-1·L-1、（11.45±1.25）nmol·mg-1·L-1、（14.61±1.57）nmol·mg-1·L-1、（17.91±1.64）nmol·mg-1·L-1、（21.44±2.15）nmol·mg-1·L-1、（13.82±1.43）nmol·mg-1·L-1。与对照组相比，模型组细胞ATP 含量降低（t=11.54，P＜0.05）；与模型组相比，UA 低、中、高剂量组细胞ATP 含量剂量依赖性上升（t分别=3.86、7.67、9.84，P均＜0.05）；与UA 高剂量组相比，UA 高剂量+BBP组细胞ATP含量降低（t=7.23，P＜0.05）。

2.6 各组细胞SphK1、S1PR1、ERK1/2 蛋白表达水平比较见图1

由图1 可见，与对照组相比，模型组细胞SphK1、S1PR1、ERK1/2 表达增加；与模型组相比，UA 低、中、高剂量组细胞SphK1、S1PR1、ERK1/2 表达剂量依赖性下降；与UA 高剂量组相比，UA 高剂量+BBP组细胞SphK1、S1PR1、ERK1/2表达增加。

图1 各组大鼠心肌组织蛋白表达

3 讨论

心肌供氧失衡会导致心肌缺血，启动缺血级联反应：从心内膜到心外膜的氧合不足造成细胞糖原减少、肌原纤维松弛、肌膜破裂等一系列心肌细胞损伤表现。寻找干预H/R的有效靶点是降低心肌细胞损伤的关键[7]。研究发现，心肌梗死或心肌H/R细胞增殖能力下降、凋亡率增加，心脏功能受损[8,9]。与之一致的是，本研究使用H9c2 细胞制备H/R 模型，发现H/R模型细胞增殖活力降低、凋亡率增加，说明模型建立成功。已有研究提出，βCD/UA 包合物能改善大鼠H/R心肌损伤[3]，本研究以低、中、高三种浓度的UA 处理H/R H9c2细胞，均能促进细胞的增殖活力、降低凋亡率，说明UA 能够减轻H/R H9c2 细胞损伤。

炎症反应与心肌损伤密切相关[10]。IL-1β、IL-6是两种重要的促炎细胞因子，在缺血性心脏病中表达升高，抑制促炎细胞因子的分泌和积累是预防缺血性心脏病的有效策略[11]。本次研究数据发现，UA显著逆转了H/R H9c2细胞上清液中IL-1β、IL-6的水平。激活的免疫细胞和炎症细胞的能量需求增加共同作用，加速了微环境缺氧和线粒体功能障碍，有利于增加活性氧，造成氧化损伤，并进一步促进炎症反应[12]。MDA 是活性氧在应激条件下产生的活性醛衍生物；SOD 是一种源于生命体的活性物质，可以清除过高浓度的活性氧以保护细胞免受伤害[13]。本研究发现，UA 也能够降低H/R H9c2 细胞上清液中MDA 水平，增加SOD 水平，提示UA 对H/R H9c2 细胞的保护作用可能与抑制炎症反应和氧化应激有关。

神经鞘磷脂存在于脑和神经组织中，是构成细胞膜的重要结构分子，还能传递信号，参与细胞生长、分化、增殖、凋亡等关键环节，鞘磷脂代谢异常与多种疾病过程有关[14]。神经鞘磷脂降解为神经酰胺，继而降解为鞘氨醇（sphingosine，Sph），Sph 在SphK1 的作用下又降解为S1P。S1P 信号较为复杂，其分子作用主要依赖于其受体S1PR 的表达[15]。SphK1、S1PR1 和S1P 广泛分布在大脑、心脏、肺、脾脏组织中并呈高表达。SphK1/S1P 信号通路涉及肿瘤、自身免疫、炎症等多种疾病的病理生理反应[16]。抑制SphK1/S1P 信号通路有助于减轻缺血性心脏病的炎症反应，保护心肌细胞[17]。本研究发现，H/R H9c2 细胞SphK1、S1PR1 表达增加，说明SphK1/S1P 信号激活，UA 干预显著下调H/R H9c2细胞SphK1、S1PR1 的表达，这可能是减轻H/R H9c2 细胞损伤的机制之一。为了验证这一猜想，本次研究使用BBP 作为SphK1/S1P 信号的激活剂，结果提示，BBP 与UA 联合使用完全沉默UA 对H/R H9c2细胞的保护作用，进一步证实UA对H/R H9c2细胞的保护作用与抑制SphK1/S1P 信号激活有关。本次研究还检测了ATP 和ERK1/2 在各组细胞中的表达。ATP 含量的变化直接反映细胞的代谢水平，通过增强细胞代谢可以发挥对心肌细胞的保护作用[18]。ERK1/2 是调控细胞行为信号通路中的组成部分，主要在免疫受体下游发挥作用，在感染和组织损伤情况下可诱导炎症基因表达[19]。本次研究亦证实了UA 可增加H9c2 损伤细胞中ATP 水平，降低ERK1/2 表达。

综上所述，UA 可降低炎症反应与氧化应激反应，改善H/R 诱导的H9c2 细胞损伤，可能是通过抑制SphK1/S1P信号通路的激活实现的。目前，UA在缺血性心脏病中的研究较少，后续还需要从多个维度探究UA的治疗作用，进而更多地服务临床。