冬虫夏草及其近缘品中铅、镉、砷污染评价及人体健康累积风险评估方法探索△

张众谋，康帅，左甜甜，孔德娟，刘月帅，石佳，郑玉光，金红宇*，马双成*

1.中国药科大学，江苏 南京 211100；

2.中国食品药品检定研究院，北京 100050；

3.河北中医学院，河北 石家庄 050091；

4.通辽市市场检验检测中心，内蒙古 通辽 028000

冬虫夏草Cordyceps sinensis(Berk.) Sacc.为麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座和幼虫尸体的复合体，早在唐代藏族药书籍《月王药诊》中便有记载[1-2]。现代药理研究表明，冬虫夏草对免疫系统、呼吸系统、心血管系统等具有多种活性[3]。重金属包括铅（Pb）、镉（Cd）、砷（As）等，难以被降解，却可以在食物链的生物放大作用下富集进入人体，是国际公认的全球性环境污染物。中药一旦被Pb、Cd、As 污染，会在体内产生严重的生理毒性[4-6]。同时，中药中重金属超标问题已成为中药出口的重要障碍，因此对冬虫夏草及其近缘品中重金属的风险进行科学、合理的评估具有重要的意义。本研究采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）测定冬虫夏草及其近缘品中不同部位（全草、中体、子座）Pb、Cd、As的含量，综合运用单因子污染指数（Pi）法、尼梅罗综合指数法、金属污染指数（MPI）法对其污染进行评价，并尝试采用靶器官毒性剂量法（TTD）对Pb、Cd、As 联合暴露产生的人体健康风险进行评估，探索冬虫夏草及其近缘品重金属污染评价，以及人体健康风险评估方法，为中药安全性评价及相关限量标准的制修订提供参考。

1 材料

1.1 仪器

7700X 型ICP-MS 仪（美国Agilent 公司）；Mars5 型微波消解仪（美国CEM 公司）；Mill-Q 型超纯水机（美国Millipore公司）。

1.2 试药

Pb、Cd、As混合标准溶液质量浓度分别为1000、1、100 mg·L-1，调谐溶液为锂（Li）、钇（Y）、铈（Ce）、铊（Tl）、钴（Co）的混合标准溶液；内标溶液为100 μg·mL-1的Li、钪（Sc）、钪（Ge）、铑（Rh）、铟（In）、铽（Tb）、镥（Lu）、铋（Bi）的混合内标溶液（美国Agilent 公司），稀释100 倍使用；硝酸为微电子级（美国默克Sigma公司）。

1.3 样品

冬虫夏草及其近缘品来源于四川、青海、湖北、山西、江西和江苏，由中国食品药品检定研究院康帅副研究员鉴定，样品信息见表1，冬虫夏草及其近缘品性状见图1。

2 方法

2.1 ICP-MS工作条件

等离子气流量：15.0 L·min-1；蠕动泵转速：0.20 r·s-1；雾化室温度：2 ℃；辅助气流量：0.8 L·min-1；氦气流量：5 mL·min-1；载气流量：0.8 L·min-1；射频功率：1550 W；数据采样模式：跳峰采集模式；采样深度：10 mm；重复次数：3次；扫描次数：100次。

2.2 供试品溶液和空白对照溶液的制备

精密称取药材粉末（过三号筛）0.25 g，置微波消解罐中，加硝酸8.0 mL，按《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版（四部）通则“2321 铅、镉、砷、汞、铜测定法”[7]消解样品，制备供试品溶液。同法制备试剂空白溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 检测限（LOD）和定量限（LOQ）采用11 个试剂空白的3 倍标准差（SD）计算LOD，并采用10×SD 计算LOQ。LOD 和LOQ 见表2。

表2 冬虫夏草不同金属元素的LOD和LOQ μg·L-1

2.3.2 精密度试验 取Pb、Cd、As 混合标准溶液，质量浓度分别为20、1、10 μg·L-1，连续进样6 次，结果Pb、Cd、As测定值的RSD 分别为2.3%、3.6%和3.9%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 加样回收率试验 取编号为10105070317 的冬虫夏草（野生品）粉末约0.25 g，加入混合标准溶液适量，按2.1项下条件进行测定，计算回收率。结果显示，Pb、Cd、As的回收率分别为94.3%、103.6%、112.3%，符合痕量检测的回收率要求。

3 污染评价

3.1 Pi法

采用公式（1）计算全草中重金属的Pi。

式中，Ci为全草中重金属的实测值（mg·kg-1）；Si为重金属的限量标准值（mg·kg-1），参照《中国药典》2020 年版植物类中药材一致性限量指导值[7]。其中，Pi≤0.7为优良，0.7＜Pi≤1.0为安全，1.0＜Pi≤2.0为轻污染，2.0＜Pi≤3.0为中污染，Pi＞3.0为重污染。Pi越大，说明污染越严重。

3.2 尼梅罗综合指数法

采用公式（2）计算全草的综合污染指数（P综合）。

式中，P平均为Pi的平均值；Pmax为Pi的最大值。P综合≤0.7为安全，0.7＜P综合≤1.0为安全线，1.0＜P综合≤2.0为轻污染，2.0＜P综合≤3.0为中污染，P综合＞3.0为重污染。

3.3 MPI法

采用公式（3）计算全草的MPI。

式中，C为重金属的实测值（mg·kg-1）。通过MPI 比较不同样品之间重金属污染的差异，MPI 越高，说明污染程度越高。

4 健康风险评估

4.1 暴露量的计算

按公式（4）计算Pb、Cd、As 的每人每千克体质量单一重金属的日暴露量（μg·kg-1）。

式中，EF为中药材的服用频率；Ed为服用中药的年限。根据国家食品安全风险评估中心在我国11个省份20 917 名调查者的有效消费调查数据[8]，EF的P95 值为每年90 d，Ed为20 年；IR为处方中药材的Exp，参考《中国药典》2020 年版规定的冬虫夏草最大日用量为9 g；t为经过煎煮等方式提取后重金属的转移率，综合参考文献[8]和本课题组的研究结果，在水煎煮条件下，Pb、Cd、As 的t值分别为14%、14%、35%；C为样品中重金属的残留量（mg·kg-1）；W为人体体质量，以70 kg 计；AT为平均寿命天数（25 550 d）。

4.2 风险特征描述

单一重金属风险的高低由危害商（HQ）来描述，分部位按公式（5）计算样品中Pb、Cd、As 的HQ值。

式中，安全因子（SF）为10[9]。HBGV为重金属的健康指导值，采用美国环保署（US EPA）所建议的Pb、Cd、As的口服参考剂量，分别为每日每千克体质量0.003 5、0.001 0、0.000 3 mg·kg-1[10-11]。若HQ≤1，那么单一重金属暴露所产生的健康风险可以被接受；若HQ＞1，风险较高，健康风险不容忽视。

4.3 累积风险评估

采用分级别原则分部位对样品中Pb、Cd、As累积暴露产生的风险进行评估。先用低级别累积风险评估方法即危害指数（HI）法进行评估，对于风险进行初步筛查；再采用更加精确的TTD 法，对Pb、Cd、As 的累积风险进行评估。

4.3.1 HI法 HI是各化学物HQ之和，按公式（6）计算。

式中，HQPb、HQCd、HQAs分别为Pb、Cd、As的HQ。若HI＜1，则认为Pb、Cd、As 联合暴露所产生的风险可以被接受；若HI＞1，则认为风险较高，不容忽视。

4.3.2 TTD 法 TTD 法对于HI 法进行改进，是针对特定毒理作用终点风险特征描述的方法。TTD 法需考虑每一污染物质基于每一作用终点的毒理效应，计算基于每一特定作用终点效应的HQ和HI[12]。TTD 法中HI的计算公式同公式（6），所不同的是参比值HBGV 代入每一毒理效应终点的健康指导值。根据US EPA 发布的指南[13]，针对心血管、血液、神经系统、肾脏、睾丸5 种不同毒理终点的Pb 的每日允许暴露量（ADI）分别为每千克体质量0.001 3、0.004 2、0.004 2、0.000 6、0.016 7 mg·kg-1；针对心血管、血液、神经系统、肾脏、睾丸5 种不同毒理终点Cd 的ADI 分别为每千克体质量0.005 00、0.000 80、0.000 20、0.000 83、0.003 00 mg·kg-1。针对心血管、血液、神经系统、肾脏4种不同毒理终点As的ADI分别为每千克体质量0.000 3、0.000 6、0.000 3、0.090 0 mg·kg-1。若HI＜1，则认为风险可以被接受；若HI＞1，则认为风险较高，不容忽视。

5 结果

5.1 Pb、Cd、As含量分析

样品的测定结果表明，亚香棒虫草全草中Pb 的含量超标，香棒虫草全草中Cd 的含量超标，3 批冬虫夏草（野生品）及香棒虫草、亚香棒虫草、蛹虫草中全草和虫体中的As 含量超标（表3）。

表3 冬虫夏草及其近缘品不同部位中Pb、Cd、As的质量分数 mg·kg-1

5.2 安全性评价结果

如图2所示，Pb的Pi为0.05～2.36，除1 批亚香棒虫草为中污染外，其余样品均为优良；Cd 的Pi为0.01～1.85，除1 批香棒虫草为轻污染外，其余样品均为优良；As 的Pi为0.32～6.85。冬虫夏草（繁育品）为优良，1批冬虫夏草（野生品，编号为10105070060）和香棒虫草为轻污染，1 批蛹虫草为中污染，2批冬虫夏草（野生品，编号为10105070317和10105070314）和亚香棒虫草为重污染。

图2 冬虫夏草及其近缘品中Pb、Cd、As的Pi

如图3 所示，冬虫夏草及其近缘品尼梅罗P综合为0.25～5.12。其中，冬虫夏草（繁育品）为优良，1 批冬虫夏草（野生品，编号为10105070060）和香棒虫草为轻污染，1 批冬虫夏草（野生品，编号为10105070317）和蛹虫草为中污染，2 批冬虫夏草（野生品，编号为10105070317 和10105070314）和亚香棒虫草为重污染；MPI为0.24～3.43，污染程度为冬虫夏草（繁育品）=蛹虫草＜冬虫夏草（野生品）＜香棒虫草＜亚香棒虫草。

图3 Pb、Cd、As的尼梅罗P综合和MPI

5.3 HI法初步评估结果

计算每千克体质量样品中Pb、Cd、As 的Exp，结果见表4。针对Pb、Cd、As 的最敏感毒理作用终点，分别计算HQ，并计算其HI。HQ 结果说明，所有批次样品中Pb 和Cd 的HQ 均低于1。然而，由于3批冬虫夏草（野生品）虫体及1批冬虫夏草（野生品）全草中As 的HQ 高于1，导致相应的HI 高于1，风险需要被关注。

表4 冬虫夏草及其近缘品不同部位中Pb、Cd、As的Exp、HQ和HI

5.4 TTD法修正的HI结果

Pb 和Cd 的非致癌作用终点主要为心血管系统、神经系统、肾脏、血液和睾丸，As 的非致癌作用终点主要为心血管系统、神经系统、肾脏、血液。针对每一种靶器官的毒性剂量，分别计算出Pb、Cd、As 相应的HQ，进一步计算出TTD 法修正的HI（表5）。如表5 所示，作用终点为心血管和神经系统的3 批冬虫夏草（野生品）虫体及1 批冬虫夏草（野生品）全草的HI＞1，这是其As 的HQ 较高导致的，说明需要进一步关注Pb、Cd、As 联合暴露对于心血管和神经系统产生的累积健康风险。

6 讨论

本研究综合运用Pi法、尼梅罗综合指数法、MPI 法对冬虫夏草及其近缘品进行重金属污染评价。其中，Pi法可以快速筛选出主要污染因子，是评价样品质量指数和其他综合评价方法的基础，但不能全面反映样品的污染程度，需要其他方法作为补充。尼梅罗综合指数法同时兼顾了Pi的平均值和最大值，避免由于平均作用削弱污染金属的权值，突出了污染指数最大的重金属（本研究为As）对样品质量的影响，既能够反映单因子重金属污染状况，又可以反映多因子重金属污染的综合状况。MPI 法由英国科学家Tomlinson 等在1980 年提出，能直观地反映各个重金属对污染的贡献程度，并可避免污染指数加和造成的评价结果误差[14]。由评价结果可见，3 种方法得到的结果基本一致。

目前，对于重金属的健康风险评估主要基于单一重金属的单一途径暴露[15-23]，而实际上人们每天都会通过多种途径暴露于多种重金属中。中药中多种重金属进入人体后，引起联合毒性的潜在风险可能超过单一重金属。如何科学评估多种重金属残留对人体的毒性已成为监管部门关注的问题。本研究探索性地采用分级原则，对Pb、Cd、As的联合暴露开展累积风险评估。首先采用低级别的HI法对风险进行初步筛查；再针对Pb、Cd、As 不同毒理学作用靶器官，采用TTD 法对HI 法作出修正和改进。目前，国内、国际大多以简单的“剂量相加”假设为前提，采用HI法进行污染物的累积风险评估。该方法相对保守，对于数据要求相对简单，是较为务实的选择[24]。TTD 法需考虑每一污染物质基于每一作用靶器官的毒理效应，计算基于每一特定作用靶器官效应的HQ和HI，对HI法进行校正。

需要说明的是，本研究除了冬虫夏草（繁育品）外，其余样品中总As的含量较高。然而，元素的形态、价态与其毒性密切相关，本研究无论是对样品的污染评价还是对人体健康的风险评估均以风险最大化为原则，采用总As的含量进行评价和评估，得到的结果相对保守。后续研究应深入调查冬虫夏草及相关产品中As 的形态和价态，进一步提高评价、评估的准确性，建议在制定相关限量过程中除了考虑反映中国人群中药消费特点的暴露评估参数（包括中药使用频率、使用量、使用时间等）外，还应考虑累积暴露风险及元素的形态、价态，使所制定的限量更加科学。中药材的污染评价和对于人体健康的风险评估刚刚起步，本研究以珍稀名贵药材冬虫夏草及其近缘品为研究对象，探索其污染评价及人体健康风险评估方法，并基于TTD 法探索对于冬虫夏草及其近缘品中重金属联合暴露更加精确的累积健康风险评估方法，为中药安全性评价方法提供了新思路，也为进一步完善中药外源性有害残留物限量标准提供科学依据。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。