仙茅酒蒸炮制工艺研究△

张一美，王巍，李利华，朱琳，鞠成国，2*

1.辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600；

2.国家中医药管理局 中药炮制技术传承基地，辽宁 大连 116600

仙茅为石蒜科植物仙茅Curculigo orchioidesGaertn.的干燥根茎，具有补肾阳、强筋骨、祛寒湿的功效[1]。仙茅始载于《雷公炮炙论》，常用于肾阳不足、阳痿精冷、筋骨痿软、腰膝冷痛、寒虚崩漏、带下、痨虚内伤等临床现象[2]。仙茅的化学成分主要包括酚及酚苷类、桉烷类、黄酮类、多糖类、木脂素类、生物碱类、挥发油、甜味蛋白等[3]。现代药理研究表明，仙茅具有免疫调节、抗氧化、抗骨质疏松[4]、抗关节炎、抗肿瘤、保肝[5]和抗炎[6]等作用，临床上多用于治疗类风湿性关节炎、慢性肾炎、骨质疏松症、肾阳不足所致的阳痿早泄及更年期综合征等疾病[7]。

历代仙茅炮制方法主要有药汁制、泔水制、酒炒、酒浸、酒蒸等[8]。与古代炮制方法相比，现代炮制方法以酒炙法为主，其他方法已很少用或不用。本课题组前期实验发现，仙茅在经过酒炙后其补肾助阳的功效增强[9]。但传统酒炙法仅凭经验对炒制火候、炒制时间等条件进行控制，存在火候难以控制、炒制时间过长或不足、色泽不均匀等弊端。而酒蒸法能较好地控制炮制温度和时间等。中药蒸制方法历史悠久，可追溯至春秋战国时期，《五十二病方》中有中药“清蒸”的记载[10]。至南北朝时期，《雷公炮炙论》中增加了“酒蒸”的记载[11]。《景岳全书》对仙茅有“用酒拌蒸之”的记载[12]，蒸制后药物的不良反应和毒性有所减少或消除。中药蒸制的目的除了沿袭明清时期的观点——增强药效、减少不良反应、改变及缓和药性、便于切制等，还增加了保持药效、利于贮存等目的。

仙茅补肝肾、强筋骨的有效成分以酚苷类化合物为主，仙茅苷是其发挥补肝肾作用的有效成分之一[13]。《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020 年版中规定以仙茅苷为指标性成分进行仙茅的质量控制[1]。仙茅中含量较高的成分有苔黑酚龙胆二糖苷和苔黑酚葡萄糖苷等，其为仙茅发挥强筋骨作用的有效成分[14]。本研究采用正交试验设计法，以加酒量、闷润时间、蒸制时间为考察因素，以仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷及醇溶性浸出物含量为评价指标，优选酒蒸仙茅炮制工艺，以期为酒蒸仙茅饮片的规范化、标准化、工业化生产提供参考。

1 材料

1.1 仪器

C21-WT2118 型电磁炉（美的集团股份有限公司）；DFT-200 型高速万能粉碎机（浙江温岭市林大机械有限公司）；e2695 型高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；XMTD-8222 型电热恒温鼓风干燥箱、FA1004B 型万分之一电子天平（上海精宏试验设备有限公司）；AE240型十万分之一电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-250E 型医用超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-4 型数显恒温水浴锅（上海江星仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品仙茅苷（批号：S0818AS，纯度＞98%）、苔黑酚龙胆二糖苷（批号：J1014AS，纯度＞98%）均购自大连美仑生物技术有限公司；苔黑酚葡萄糖苷（北京索莱宝科技有限公司，批号：1206A022，纯度≥98%）；黄酒（浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司，批号：20210119，酒精度：10%）；乙腈、甲醇、磷酸均为色谱纯；娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

仙茅样品（批号：2208001）购自安国市聚药堂药业有限公司，经辽宁中医药大学中药鉴定室李峰教授鉴定为石蒜科植物仙茅Curculigo orchioidesGaertn.的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 酒制仙茅的制备

2.1.1 传统酒炙法 取生仙茅饮片20 g，置密闭容器内，加入黄酒（每100 kg 饮片加入黄酒10 kg）拌匀，闷润，待黄酒被吸尽后，置锅中，以文火炒干，取出，放凉，即得[15]。

2.1.2 酒蒸法 取生仙茅饮片20 g，置密闭容器内，加入黄酒（每100 kg 饮片加入黄酒20 kg）拌匀，闷润1 h，置锅中，蒸制1 h，取出放凉，50 ℃干燥，即得。

2.2 醇溶性浸出物的测定

按《中国药典》2020 年版通则2201 项下醇溶性浸出物测定法中的热浸法进行测定[16]。

2.3 含量测定

2.3.1 色谱条件 1）仙茅苷：Xtimate C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.1%磷酸水溶液-乙腈（76∶24）为流动相；流速为1 mL·min-1；检测波长为210 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 µL[17]。2）苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷：Xtimate C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相进行梯度洗脱（0～7 min，95%～90%B；7～20 min，90%B）；流速为0.6 mL·min-1；检测波长为220 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 µL[17]。

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷对照品适量，分别加入甲醇溶解稀释，混匀，制得仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷、苔黑酚龙胆二糖苷质量浓度分别为0.245 0、0.572 5、1.377 5 mg·mL-1的单一对照品母液[17]备用。

2.3.3 供试品溶液的制备 取2.1.2 项下酒蒸仙茅样品粉末（过三号筛，下同）1.0 g，精密称定，加入甲醇50 mL，称定质量，于水浴锅中加热回流2 h，取出放冷，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取上述滤液20 mL，蒸干，残渣加入甲醇复溶，转移至10 mL 量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，经0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。同法制得仙茅生品及酒炙品的供试品溶液。

2.3.4 系统适用性试验 取上述各供试品溶液及单一对照品溶液适量，按2.3.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图（图1）。

2.3.5 线性关系考察 分别精密吸取2.3.2 项下各单一对照品母液适量，用甲醇稀释，制成仙茅苷质量浓度分别为7.70、15.30、30.60、61.30、122.50、245.00 μg·mL-1，苔黑酚龙胆二糖苷质量浓度分别为17.89、35.78、71.56、143.10、286.30、572.50 μg·mL-1，苔黑酚葡萄糖苷质量浓度分别为 43.00、86.10、172.20、344.40、688.80、1 377.50 μg·mL-1的各单一对照品线性溶液，按2.3.1 项下色谱条件进样测定。以各待测成分进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表1。

表1 仙茅中3个成分线性关系

2.3.6 精密度试验 分别精密吸取2.3.2 项下各单一对照品溶液适量，按2.3.1 项下色谱条件连续进样6 次，仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷峰面积的RSD 分别为0.44%、0.30%、0.27%，表明仪器精密度良好。

2.3.7 稳定性试验 取2.3.3 项下供试品溶液（仙茅生品）适量，按2.3.1 项下色谱条件进行测定，分别于0、2、4、8、12、24 h 进样，仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷峰面积的RSD 分别为0.13%、0.37%、0.21%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.8 重复性试验 取仙茅生品样品粉末 1.0 g，共6 份，按2.3.3 项下方法制备供试品溶液，并按2.3.1 项下色谱条件进行测定，仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷的平均质量分数分别为0.099%、0.387%、0.649%，RSD 分别为0.36%、0.54%、0.30%，表明该方法重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验 精密称取6 份已知含量的同一批仙茅样品（生品）粉末，每份0.1 g，分别加入各单一对照品溶液适量，按2.3.3 项下方法制备供试品溶液，并按2.3.1 项下色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表2。

表2 仙茅中3个成分加样回收率试验结果

2.4 单因素试验

本研究选择加酒量、闷润时间、蒸制时间进行单因素试验。同时，参考文献[17-19]确定各因素的权重，3 个化学成分及醇溶性浸出物含量的权重均为25%。按公式（1）计算综合评分。

式中W表示仙茅苷含量，X表示苔黑酚葡萄糖苷含量，Y表示苔黑酚龙胆二糖苷含量，Z表示醇溶性浸出物含量，综合评分分值越高表示样品质量越好[20]。

2.4.1 加酒量 取5 份生仙茅饮片，每份20 g，加入不同比例黄酒，至密闭容器内闷润3 h 后，蒸制2 h，取出放凉，50 ℃干燥。考察不同加酒量（5%、10%、15%、20%、25%）对综合评分的影响。当加酒量为15%时，综合评分最高，故选择加酒量10%～20%进行正交试验设计，见表3。

表3 不同加酒量对酒蒸仙茅中3个成分及浸出物质量分数、综合评分的影响

2.4.2 闷润时间 取5 份生仙茅饮片，每份20 g，加入15%黄酒，至密闭容器内闷润不同时间后，蒸制2 h，取出放凉，50 ℃干燥。考察不同闷润时间（1、2、3、4、5 h）对综合评分的影响。当闷润时间为1 h时，综合评分最高，闷润时间少于1 h时存在不能完全润透的情况，而闷润2 h或3 h时综合评分较高，故选择闷润时间1～3 h进行正交试验设计，见表4。

表4 不同闷润时间对酒蒸仙茅中3个成分及浸出物质量分数、综合评分的影响

2.4.3 蒸制时间 取5份生仙茅饮片，每份20 g，加入15%黄酒，至密闭容器内闷润1 h，蒸制不同时间，取出放凉，50 ℃干燥。考察不同蒸制时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）对综合评分的影响。当蒸制时间为1.0 h时，综合评分最高，其次为1.5、2.0 h，而蒸制时间少于1.0 h时，不能完全蒸透，故选择蒸制时间1.0～2.0 h进行正交试验设计，见表5。

表5 不同蒸制时间对酒蒸仙茅中3个成分及浸出物质量分数、综合评分的影响

2.5 正交试验

2.5.1 正交试验设计 在单因素试验的基础上，本研究以加酒量（A）、闷润时间（B）、蒸制时间（C）为考察因素，仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷和醇溶性浸出物含量的综合评分为评价指标，采用L9（34）设计试验。酒蒸仙茅炮制工艺的因素与水平见表6，试验设计方案与结果见表7，方差分析结果见表8。

表6 酒蒸仙茅炮制工艺正交试验因素水平

表7 酒蒸仙茅炮制工艺正交试验设计方案与结果

表8 酒蒸仙茅炮制工艺正交试验方差分析

由表7可知，各因素对3个酚苷类成分和醇溶性浸出物含量影响为A＞B＞C，最优组合为A3B2C3。由表8 可知，因素A、B、C 影响差异无统计学意义。为节约时间，最终确定最优工艺为A3B1C1，即加酒量20%、闷润时间1 h、蒸制时间1 h。

2.5.2 验证实验 取3 份生仙茅饮片，每份100 g，按上述最优酒蒸炮制工艺制备3 批酒蒸仙茅样品，再按2.2、2.3 项下方法分别测定含量，并计算综合得分，结果见表9。综合评分的RSD为0.71%，表明所得最优酒蒸仙茅工艺稳定、可行。

表9 酒蒸仙茅炮制工艺验证实验结果

2.6 仙茅生品、酒炙品及酒蒸品含量比较

取生仙茅饮片20 g，分别按2.1.1、2.1.2 项下方法分别制备酒炙品和酒蒸品，再按2.2、2.3 项下方法分别测定生仙茅饮及2 种炮制品中仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷、苔黑酚龙胆二糖苷和醇溶性浸出物的含量，结果见表10。结果显示，酒蒸仙茅的仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷及醇溶性浸出物含量均高于仙茅生品和酒炙品。

表10 仙茅生品、酒炙品及酒蒸品中仙茅苷、苔黑酚葡萄糖苷、苔黑酚龙胆二糖苷、浸出物质量分数比较 %

3 讨论

汉代开始陆续出现了酒制中药的方法，近几十年来，对于酒制中药的研究一直在持续进行。现代较为常用的酒制法包括酒炙、酒蒸、酒淬等。酒制中药所用的辅料酒分为黄酒和白酒，现代中药在酒制时，以黄酒为主。黄酒气味芳香、主行药势、能入血分、可通血脉、能升能散，有活血通络、和血行气、散寒祛腥的作用[21]。炮制用辅料黄酒应该清亮透明、无沉淀杂质，不应有异味，颜色应为橙黄至深褐色。黄酒中含有醇，醇有促进血液循环、兴奋心脏等作用。酒制中药时，黄酒与中药充分拌匀润透，可渗入组织内部，对中药内部组织的物理状态有所改变，对成分的溶解、扩散、置换、溶出等有促进作用，酒制传统炮制理论有“借酒力以上腾也”“酒制升提”等[15]。

基于“相资为制”的制药理论，以热性的黄酒炮制热性的仙茅，能够增强仙茅补肾温阳的作用。目前，《中国药典》2020 年版对于仙茅的炮制方法也以酒炙法为主，对酒蒸仙茅的研究较少。但酒炙法存在火力不均、火候难以控制等问题，而酒蒸法则能使饮片受热均匀，且由于其操作过程中处于密闭环境，减少了对饮片的污染。故本研究选择对酒蒸仙茅炮制工艺进行研究，以期提高其临床疗效和用药安全性，为临床用药提供新思路。

本研究经实验考察，以本课题组前期研究为参考[17]，发现以2.3.1项下色谱条件测定仙茅苷、苔黑酚龙胆二糖苷、苔黑酚葡萄糖苷含量时，其色谱峰分离度较好、基线较为平稳。故选择以2.3.1 项下色谱条件对其进行检测。

本研究采用酒蒸法，以加酒量、闷润时间、蒸制时间为考察因素，结合综合加权评分对工艺进行优化，得到仙茅酒蒸最佳工艺为加酒量20%，闷润时间1 h，蒸制时间1 h。经验证，所得最优酒蒸仙茅炮制工艺具有一定的科学性与可行性。仙茅经酒蒸后，与仙茅生品及传统酒炙品相比，其醇溶性浸出物及3 个成分含量均有所升高。这可能是由于在炮制过程中，黄酒进入仙茅内部，促进其有效成分的溶出、仙茅中的其他化学成分发生了转化等，具体原因还有待进一步研究。

酒蒸仙茅的炮制方法在明代的《景岳全书》[12]、现代的《辽宁省中药饮片炮制规范》1975 年版[22]及《云南省中药饮片炮制规范》1986 年版[23]中均有记载，但其炮制工艺各不相同。由于炮制工艺变化较大，且中药成分较为复杂，故本研究选择对仙茅酒蒸工艺进行优化。现代对生仙茅及酒炙仙茅临床应用记载较多，而对酒蒸仙茅临床应用却鲜有记载，故后续尚需对其质量标准、药理实验、化学成分分析、临床疗效等进行更深入的研究，以期为酒蒸仙茅临床应用提供参考。

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