基于标准汤剂的竹叶柴胡配方颗粒质量标准研究△

王艳芳，娄涛涛，孙宜春，向家俊，许洋木，卿勇军，李慧馨

国药集团同济堂（贵州）制药有限公司，贵州 贵阳 550009

竹叶柴胡Bupleurum marginatumWall.ex DC.为伞形科（Umbeliferae）柴胡属（BupleurumL.）植物，多为西南地区民间习用品，以全草入药，现收入《贵州省中药材、民族药材质量标准》2003 年版[1]。有研究报道竹叶柴胡含有柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c等30余种皂苷类化合物，以及槲皮素、儿茶素、芦丁等黄酮类化合物，现代药理学研究表明其具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用，为药用柴胡重要的基原，临床应用历史悠久[2-4]。目前，也有研究报道借助指纹图谱及指标成分含量测定等分析手段对竹叶柴胡的质量进行控制，但并无基于标准汤剂的竹叶柴胡配方颗粒的相关性研究，全面控制竹叶柴胡配方颗粒质量的研究也较少。中药配方颗粒是由单味中药经水提、分离、浓缩、干燥等程序制粒所得，既有现代药品的特点，又保留着传统中医药的特色，可按中医临床处方调配后直接冲服，而质量控制是确保中药配方颗粒临床疗效的基本保障[5-6]。因此，本研究采用超高效液相色谱法（UPLC）建立了基于标准汤剂的竹叶柴胡配方颗粒的指纹图谱及芦丁含量测定方法，并开展基于饮片-标准汤剂-配方颗粒的关联性研究，以期为竹叶柴胡配方颗粒的质量管理提供参考。

1 材料

1.1 样品

15 批竹叶柴胡药材均采自贵州，经贵州中医药大学李伟教授鉴定为伞形科（Umbeliferae）柴胡属（BupleurumL.）植物竹叶柴胡Bupleurum marginatumWall.ex DC.的全草，样品信息见表1。

表1 竹叶柴胡饮片、标准汤剂及配方颗粒信息

1.2 试药

对照品芦丁（批号：111871-202007，纯度：98.1%）、槲皮素（批号：100081-201610，纯度：99.1%、竹叶柴胡对照药材（批号：121343-201903）均购于中国食品药品检定研究院；麦芽糊精[中粮生化能源（公主岭）有限公司]；甲醇、乙腈均为色谱纯，购于美国Fisher 公司；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器

A1290 型超高效液相色谱仪（Agilent 公司）、Vanquish F 型超高效液相色谱仪（赛默飞世尔科技有限公司）；KQ-500DB 型超声波样品处理机（济宁天之蓝生物科技有限公司）；ML204 型万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多电子天平有限公司）；HH-4型数显恒温水浴锅（常州金坛良友仪器有限公司）；YMW 型分体煎药壶（深圳一枚王有限公司）；Direct-Pure 型超纯水系统（上海瑞枫科学仪器有限公司）。

2 方法与结果

2.1 竹叶柴胡标准汤剂及配方颗粒的制备

根据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》[7]制备竹叶柴胡标准汤剂冻干粉，根据标准汤剂的标准制备竹叶柴胡配方颗粒。

竹叶柴胡饮片制备：取竹叶柴胡药材，除去杂质及残茎，洗净，润透，切段（10～15 mm），干燥，即得。

竹叶柴胡标准汤剂制备方法：取竹叶柴胡饮片100 g，加12倍量水，浸泡30 min，采用砂锅先武火煮沸，再文火煎煮30 min，300目滤布趁热滤过，药渣再加10倍量水，先武火煮沸，再文火煎煮20 min，300 目滤布趁热滤过，合并滤液；在65 °C 减压浓缩成浸膏，冷冻干燥，即得竹叶柴胡标准汤剂冻干粉。

竹叶柴胡配方颗粒制备方法：取竹叶柴胡（竹叶柴胡）饮片7700 g。加水煎煮，滤过，滤液浓缩成清膏（干膏出膏率为6.1%～13.0%），加入辅料适量，干燥，再加入辅料适量，混匀，制粒，制成1000 g，即得。

2.2 指纹图谱方法建立

2.2.1 色谱条件 ACQUITY® HSS T3 色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），以乙腈（A）-0.1%乙酸水溶液（B）为流动相梯度洗脱（0～25 min，5%～25%A；25～30 min，25%～45%A；30～33 min，45%～95%A），柱温为35 ℃，进样量为1 μL，检测波长为255 nm，体积流量为0.30 mL·min-1。

2.2.2 对照品溶液的制备 取竹叶柴胡对照药材约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。取芦丁对照品加75%甲醇制成0.1 mg·mL-1的溶液，摇匀，作为芦丁对照品溶液。取槲皮素对照品加75%甲醇制成0.1 mg·mL-1的溶液，摇匀，作为槲皮素对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取竹叶柴胡饮片粉末（过三号筛）约1 g，精密称定，另依次取竹叶柴胡配方颗粒、标准汤剂冻干粉适量，精密称定，置已编号的具塞锥形瓶中，依次精密加入75%甲醇25 mL，称定质量，超声（500 W，40 kHz）30 min，放冷，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 指纹图谱方法学考察

2.3.1 专属性试验 取配方颗粒、空白溶剂及阴性样品（只含辅料），按2.2.3 项下方法分别制备供试品、阴性样品溶液，按2.2.1 项下色谱条件上机检测。由图1 可知，阴性样品及空白溶液均无干扰，表明该方法专属性良好。

图1 竹叶柴胡配方颗粒指纹图谱专属性试验

2.3.2 精密度试验 按2.2.3 项下方法制备1 份供试品溶液，在2.2.1项下色谱条件重复进样6次，标定6个共有峰，以芦丁（峰3）为参照峰，计算相对保留时间及相对峰面积。各色谱峰相对保留时间的RSD为0～0.39%，相 对峰面积的RSD为0.27%～0.98%，该仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 按2.2.3 项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件测定。以峰形较好且峰面积较大的芦丁（峰3）的保留时间和峰面积为参照，计算其他共有峰的相对保留时间和峰面积。结果各色谱峰相对保留时间RSD为0～0.56%，相对峰面积的RSD为0.51%～1.12%，表明该方法的重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取同一批配方颗粒供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h 按2.2.1 项下色谱条件进样，测得各色谱峰相对保留时间的RSD 均小于2.0%，相对峰面积的RSD 均小于2.0%，说明该样品溶液在24 h内较稳定。

2.3.5 耐用性试验 取同一批配方颗粒样品，按2.2.3 项下方法制备供试品溶液，分别采用Agilent 1290Ⅱ、Thermo Vanquish F 色谱仪及3 根不同品牌的色谱柱测定，以峰形较好且峰面积较大的芦丁（峰3）的保留时间和峰面积为参照，结果显示各共有峰相对保留时间的RSD为0.15%～0.50%，表明该方法对不同仪器具有良好的耐用性；与其他2 个品牌色谱柱（Dikma C18-AQ 与Shim-pack GISS-HP C18-AQ）相比较，Waters ACOUITY UPLC® HSS T3 色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）的6 个共有峰峰形较好，分离效果最佳，表明该方法对不同色谱柱的耐用性较低。

2.3.6 共有峰的确定 精密吸取各对照品溶液及供试品溶液各1 μL，于2.2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图。以对照药材作为参照，选择出峰稳定、峰形和分离度较好的6 个色谱峰作为共有峰，其中峰3（S）与芦丁对照品色谱峰的保留时间相对应，峰6 与槲皮素对照品色谱峰的保留时间相对应（图2）。

图2 竹叶柴胡配方颗粒指纹图谱峰指认检测图谱

取15 批标 准汤剂（S1～S15）、3 批配方 颗粒（S16～S18）和对应3批竹叶柴胡饮片（S19～S21）根据2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版），结果见图3、图4。采用多点校正后，对共有峰进行Mark匹配，结果显示15 竹叶柴胡批标准汤剂的相似度为0.951～0.990，3批配方颗粒的相似度为0.973～0.986，3 批竹叶柴胡药材对应饮片的相似度为0.953～0.979，三者相似度均高于0.90，表明竹叶柴胡饮片、标准汤剂及配方颗粒之间相似度良好。以峰形较好且峰面积较大的峰3（S）作为参照峰，测得各共有峰相对保留时间RSD为0～0.17%，且其相对保留时间均在规定值的±10%之内，规定值为0.30（峰1）、0.48（峰2）、1.04（峰4）、1.20（峰5）、1.60（峰6）。比较3 批配方颗粒（S16～S18）及相应3 批标准汤剂（S2～S4）、3 批竹叶柴胡饮片（S19～S21）的指纹图谱，发现前者（配方颗粒）均呈现与后两者（即标准汤剂、竹叶柴胡饮片）相同的6 个共有峰，并且相对保留时间基本一致，表明现行生产工艺能使竹叶柴胡指纹图谱量值得到稳定传递，从而确保配方颗粒与标准汤剂、饮片的一致性，结果见表2。

图3 竹叶柴胡配方颗粒指纹图谱对照图谱

图4 竹叶柴胡饮片、标准汤剂及配方颗粒指纹图谱

表2 15批竹叶柴胡标准汤剂、3批配方颗粒及对应3批饮片相对保留时间分析结果

2.4 含量测定

2.4.1 色谱条件

采用迪马Endeavorsil C18-A 色谱柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），以乙腈（A）～0.1%甲酸水溶液（B）为流动相梯度洗脱（0～22 min，10%～48%A），柱温为30 ℃，流速为0.20 mL·min-1，检测波长为354 nm，进样量为1 μL。理论板数按芦丁峰计应不低于8000。

2.4.2 溶液制备

2.4.2.1 对照品溶液制备 取芦丁对照品适量，加75%甲醇制成质量浓度为50 μg·mL-1的芦丁溶液，混匀，即得。

2.4.2.2 供试品溶液制备 取1 批配方颗粒研细混匀约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，称定质量，超声（500 W，40 kHz）60 min，放冷，用75%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.2.3 阴性样品及空白溶剂制备 取辅料麦芽糊精（按竹叶柴胡配方颗粒制备工艺）颗粒（批号：210604）约0.1 g，按2.4.2.2 项下方法制备，即得。取75%甲醇作为空白溶液。

2.5 含量测定方法学考察

2.5.1 专属性试验 取配方颗粒及阴性样品，按2.4.2 项下方法分别制备对照品、供试品、阴性样品溶液。取供试品、对照品、阴性样品溶液及空白溶剂适量，按2.4.1项下色谱条件测定，结果见图5，供试品在与芦丁对照品相应的保留时间的位置上出峰，且空白溶剂及阴性样品均无色谱峰流出，对供试品测定无干扰，表明该方法的专属性良好。

图5 竹叶柴胡配方颗粒含量测定专属性试验图谱

2.5.2 线性关系考察 分别精密吸取芦丁对照品储备液适量，依次稀释1、2、2.5、5、10、20 倍，即得不同质量浓度的芦丁对照品溶液，按照2.4.1 项下色谱条件进样测定，以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积值为纵坐标（Y）进行回归，结果显示Y＝0.199 9X+0.336 6（r＝0.999 3），表明芦丁质量浓度为0.01～0.20 mg·mL-1时与其峰面积线性关系良好。

2.5.3 精密度试验 精密吸取2.4.2.2 项下制备的供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件连续进样6次测定。计算芦丁质量分数的RSD为0.09%，表明该仪器的精密度良好。

2.5.4 重复性试验 取同一批竹叶柴胡配方颗粒按2.4.2.2 项下方法平行制备6 份供试品溶液，按2.4.1.项下色谱条件进行测定。计算芦丁质量分数的RSD为1.72%，表明该方法的重复性良好。

2.5.5 稳定性试验 按2.4.2.2 项下方法制备1 份供试品溶液，按2.4.1 项下色谱条件分别在0、2、4、8、10、12、24 h 进样测定。计算芦丁质量分数的RSD为0.57%，说明该溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.6 耐用性试验 取竹叶柴胡配方颗粒供试品溶液，按2.4.1 项下色谱条件，采用不同品牌的色谱柱（Dikma Endeavorsil C18-A、Inerstil ODS-3 C18及Acclaim Vanquish C18）对其进行检测分析，计算芦丁质量分数的RSD为1.21%，表明该方法对不同类型的色谱柱耐用性良好。取竹叶柴胡配方颗粒供试品溶液2 份，按2.4.1 项下色谱条件，采用Agilent 1290Ⅱ、ThermoVanquish F 不同型号的UPLC 分别对其检测分析。计算芦丁质量分数的RSD为0.61%，表明该方法对不同仪器具有良好的耐用性。

2.5.7 加样回收试验 取已知含量竹叶柴胡配方颗粒（芦丁质量分数为6.6 mg·g-1）0.1 g，精密称定共6份，加入芦丁对照品溶液适量，按2.4.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.4.1项下色谱条件测定，计算回收率（表3）。结果显示芦丁的平均回收率为103.19%，RSD为1.10%，表明该含测方法的准确度良好。

表3 竹叶柴胡配方颗粒芦丁加样回收试验结果

2.6 样品含量测定

分别取15 批标准汤剂、3 批配方颗粒及3 批竹叶柴胡饮片粉末，按2.4.2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.4.1 项下色谱条件进行检测分析，计算各样品中芦丁的含量。15 批竹叶柴胡标准汤剂（S1～S15）中指标成分芦丁的质量分数分别为10.42、8.40、12.31、8.22、10.54、9.91、10.92、7.84、8.23、9.28、7.47、11.02、10.81、12.65、9.10 mg·g-1，平均质量分数为9.61 mg·g-1，SD为1.41，均值的70%～130%为6.73～12.49，均值±3SD为5.38～13.83 mg·g-1，各批次芦丁含量均符合标准；测定3批配方颗粒中芦丁的质量分数也在多批次标准汤剂限度范围之内，且从饮片到配方颗粒芦丁的转移率高达60%，表明竹叶柴胡指标成分在饮片-标准汤剂-配方颗粒研究过程中量值传递较好（表4）。

表4 3批竹叶柴胡药材对应饮片、颗粒剂中芦丁的质量分数及转移率测定结果

3 讨论

3.1 指纹图谱方法的优化

本研究对提取溶剂（不同质量分数甲醇、乙醇及水溶液）、提取方法（振荡、超声及热回流法）、流动相（乙腈-水、乙腈-甲酸水、甲醇-水及甲醇-甲酸水）及其初始比例、等度洗脱与梯度洗脱、检测波长及柱温等进行考察，以供优选出最佳提取方式和色谱条件。其中，以75%甲醇超声提取所得竹叶柴胡配方颗粒的色谱图基线平、出峰数目多、峰形及分离效果好，因此，选择75%甲醇作为最佳提取溶剂进行后续实验。指纹图谱指认了槲皮素和芦丁2个成分，由于芦丁质量分数最高，达千分之一以上，而槲皮素成分质量分数低于万分之一，误差较大，因此，本研究以芦丁作为含量测定指标，其槲皮素成分不作测定要求。这与相关文献报道一致[8-10]。

3.2 含量测定指标的选择及方法的优化

研究报道发现竹叶柴胡含有柴胡皂苷a、柴胡皂苷b、柴胡皂苷c等30余种皂苷类化合物[12]，经前期预实验对本研究所用竹叶柴胡饮片中3 个柴胡皂苷化合物进行检测，发现其含量均低于万分之一，而芦丁作为黄酮类成分其含量在竹叶柴胡饮片中高达1%以上，且现代药理学发现其具有抗氧化、抗炎及保护心血管作用[11]，因此，本研究将芦丁作为指标成分，并对其建立含量测定方法。

本研究在芦丁含量测定方法的建立时考察了水、不同体积分数的甲醇和乙醇对其提取效果的影响，结果显示75%甲醇提取效率最高；对流动相洗脱梯度进行逐步优化发现，采用梯度洗脱色谱峰峰形好、基线平稳、分离度符合分析要求，且芦丁可实现基线分离，因此，最终选择梯度洗脱进行色谱分离。同时比较了振荡、超声和回流提取3种提取方式对提取效率的影响，结果显示超声处理60 min 的提取效果最佳，操作简单。

3.3 量值传递分析

本研究基于传统中医药理论指导，引入标准汤剂的研究理念，对竹叶柴胡饮片-标准汤剂-配方颗粒进行系统研究，以指纹图谱和配方颗粒中芦丁指标成分的含量为研究目标和评价指标，15 批标准汤剂中芦丁指标成分含量实测值均为均值±3SD，未出现离群数值，且3 批配方颗粒中芦丁含量也在标准汤剂范围内。竹叶柴胡饮片、标准汤剂、配方颗粒指纹图谱相似度均大于0.90，表明从饮片至配方颗粒其芦丁的转移率高达60%，能够稳定传递，最大限度地保证了竹叶柴胡配方颗粒与标准汤剂的等效性和质量一致性，进而确保临床疗效。

综上所述，本研究建立了基于标准汤剂的竹叶柴胡配方颗粒指纹图谱及指标成分芦丁的含量测定方法，较完整客观地反映了竹叶柴胡配方颗粒生产过程的相关性及量值传递的规律，为指纹图谱及含量测定用于竹叶柴胡配方颗粒生产过程的监控及质量管理提供研究依据。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。