双黄连口服液质量一致性评价研究△

劳永真，徐凌川，赵桉熠，苏江敏，郭丛，刘安，章军*，刘艳*

1.中国中医科学院 中药研究所，北京 100700；

2.山东中医药大学，山东 济南 250355

双黄连口服液（SHLO）是由金银花、黄芩、连翘按一定工艺制成的中药制剂，方中金银花清风温热、黄芩清肠中湿热、连翘清心泻火，主要用于外感风热所致的发热、咳嗽、咽痛等[1]。SHLO 的生产厂家有12家，市场规模超10亿，但有研究表明，不同生产厂家产品质量存在差异[2]。目前，关于SHLO的质量评价方法较多，主要为采用红外光谱法[3]、紫外光谱法[4]、高效液相色谱串联质谱法[5]、核磁共振法[6]等方法对样品中连翘酯苷A、绿原酸、咖啡酸、黄芩苷、木犀草素、黄芩苷、五福花苷酸等成分和总黄酮[7-13]进行定性定量检测。另有学者通过建立SHLO指纹图谱评估样品质量[14]，或利用生物效价评价方法测定SHLO 样品的抗菌性[15]。虽然已有方法可从不同角度检测SHLO 的有效成分、生物效应等，但这些数据基于不同平台和不同样品，彼此之间不能贯通使用，无法体现同类产品的优劣和一致性差异，无法区分市售产品的质量等级。

本研究旨在探索SHLO 的质量一致性，一方面将成药指标成分与原料药关联，运用高效液相色谱法（HPLC）对来自SHLO 中3 味原料的6 个指标成分进行定性定量分析；另一方面将成药指标成分与生产制造相关联，考察样本批内、批间质量差异，运用批内一致性差异值（PA）、批间一致性差异值（PB）、指纹图谱相似率（PC）3个参数量化质量均一化水平，结合主成分分析（PCA）模型实现不同厂家SHLO 质量一致性评估，为SHLO 的质量提升提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1260 型高效液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司，包括G7117C 型四元梯度泵、G7129C 型自动进样器、G7116A 型柱温箱、G7104 型二极管阵列检测器）；XSR105/A 型十万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；KQ-250DB 型超声波清洗仪（苏州昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品新绿原酸（批号：BCY-000316，纯度≥98%）、绿原酸（批号：BCY-000315，纯度≥98%）、连翘酯苷A（批号：BCY-000491，纯度≥98%）、黄芩苷（批号：BCY-000376，纯度≥98%）、连翘苷（批号：BCY-000490，纯度≥98%）均购于江西佰草源生物科技有限公司；对照品汉黄芩苷（批号：1119-090905，纯度≥98%，中药固体制剂制造技术国家工程研究中心有限公司）；乙腈（色谱纯，上海星可高纯溶剂有限公司）；磷酸（色谱纯，北京迈瑞达科技有限公司）；甲醇（分析醇，天津富宇精细化工有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈饮料有限公司）。双黄连口服液（每1 mL 相当于饮片1.5 g）来自8个生产厂家，产品信息见表1。

表1 双黄连口服液样品信息

2 方法

2.1 对照品溶液制备

分别取新绿原酸、绿原酸、连翘酯苷A、连翘苷、汉黄芩苷对照品适量，用50%甲醇溶解，配制成质量浓度分别为35.3、29.9、41.9、41.3、18.9、41.3 μg·mL-1的混合对照品溶液和黄芩苷质量浓度为707.9 μg·mL-1的对照品溶液，备用。

2.2 供试品溶液制备

取本品1 mL，置25 mL 棕色量瓶中，加入50%甲醇适量，超声提取5 min（功率为250 W，频率为40 kHz），冷却至室温，用50%甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

采用Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流速为0.9 mL·min-1；柱温为35 ℃；进样体积为5 μL；流动相0.4%磷酸（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～10 min，91%～88%A；10～12 min，88%～86%A；12～22 min，86%～83%A；22～48 min，83%～67%A；48～63 min，67%～36%A）；检测波长为254 nm。HPLC图见图1。

图1 对照品和SHLO样品HPLC图

2.4 质量一致性评价

为考察不同厂家样品质量一致性情况，本研究引用PA、PB、PC3个一致性参数。PA为同批号5 个包装单位样品相同指标成分含量极差值与均值的百分比[16]，当所测指标数为n时，PA为n个指标成分一致性差异值的均值，按公式（1）计算。PB为5 个不同批号样品相同指标成分含量极差值与均值的百分比[16]，当所测指标数量为n时，PB为n指标成分一致性差异值的均值，按公式（2）计算。

PC为各厂家5 个批号样品指纹图谱与生成对照图谱的相似率，取供试品溶液在254 nm 下的色谱图为指纹图谱，将图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2.0 版），采用中位数法，时间窗宽度为0.1 min，经多点校正、全峰匹配后生成的图谱为参照图谱，计算各批样品与生成图谱的相似度，相似度最小值的百分值为PC。

2.5 化学计量分析

以8 个厂家3 个一致性参数为变量，采用SIMCA-P 13.0 软件对变量以主成分特征值和累积方差贡献率进行PCA。

3 结果

3.1 方法学验证

3.1.1 线性关系 计算各成分的线性回归方程及范围，结果见表2，在相应范围内各成分的r均大于0.999 5，表明6 个成分的校准曲线表现出良好的线性相关性。

表2 SHLO中6个成分线性关系及范围

3.1.2 精密度试验 取批号为201208 的样品制备供试品溶液，按2.3 项下色谱条件，连续进样6 次，新绿原酸、绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷峰面积的RSD分别为0.2%、0.5%、0.3%、0.1%、0.7%、0.1%，表明仪器精密度良好。

3.1.3 稳定性试验 选择批号为201208 样品的供试品溶液，在0、2、4、8、12、24 h 分别进样，新绿原酸、绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷质量浓度的RSD分别0.5%、0.4%、0.2%、0.1%、0.3%、0.1%，表明供试品溶液24 h 内稳定性良好。

3.1.4 重复性试验 取批号为201208 的样品平行制备6 份供试品溶液，按2.3 项下色谱条件检测，6 份供试品溶液中新绿原酸、绿原酸、连翘酯苷A、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷质量浓度的RSD 分别0.4%、0.9%、0.9%、0.4%、0.9%、0.4%，表明该方法具有良好重复性。

3.1.5 加样回收率试验 精密称取批号为201208的样品0.5 mL，按2.2 项方法制备供试品溶液6 份。分别精密加入已知质量浓度的对照品溶液，按2.3项下条件测定，6 个成分的平均加样回收率及RSD 见表2，说明该检测方法准确性良好。

表2 SHLO中6个成分加样回收率结果

3.2 含量测定

样品中绿原酸、黄芩苷、连翘苷的质量浓度分别为0.66～1.25、12.71～21.89、0.39～0.66 mg·mL-1，依据《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》2020 年版（一部）对SHLO 的相关要求[17]，所有样品均为合格品。样品中新绿原酸、连翘酯苷A、汉黄芩苷的质量浓度分别为0.75～1.44、0.07～0.94、0.001 3～1.930 0 mg·mL-1（表3）。

表3 8个厂家40批SHLO中6个成分的质量浓度（n=2） mg·mL-1

对比不同厂家相同成分的质量均一性发现，不同厂家6 个指标成分质量浓度的RSD为0.5%～48.4%（绿原酸为2.3%～12.0%、黄芩苷为0.5%～3.6%、连翘苷为3.1%～10.6%、新绿原酸为3.2%～10.8%、连翘酯苷A为7.4%～39.7%、汉黄芩苷为10.3%～48.4%），即厂家间样品含量控制水平不一，连翘酯苷A、汉黄芩苷的质量均一性较差。

为了比较不同厂家产品的质量、分析其与原料药的关系，将6 个指标成分分为3 类并进行加和统计，以代表不同原料药的含药量结果。样品含金银花以新绿原酸和绿原酸总量计，含连翘以连翘苷和连翘酯苷A 总量计，含黄芩以黄芩苷和汉黄芩苷总量计。每个指标为来自同一厂家5 个批次的平均含药量，结果见图2。如图2所示，各厂家样品金银花的含药量为1.58～2.55 mg·mL-1，黄芩的含药量为13.67～22.76 mg·mL-1，连翘的含药量为0.60～1.29 mg·mL-1，各厂家产品质量存在明显差异。连翘含药量的差异达到每单位约2.2 倍。因采收时期不同，连翘可分为青翘和老翘。《中国药典》2020年版规定，连翘苷质量分数不得少于0.15%，青翘的连翘酯苷A 质量分数不得少于3.5%，老翘的连翘酯苷A 质量分数不得少于0.25%，因此推测各生产厂家的连翘原料可能存在青翘、老翘混合使用的情况，导致质量差异较大。另外，不同厂家对产品质量的关注点不同，如T 厂家中金银花和连翘成分含量较高，而X 厂家连翘和黄芩成分含量较高。

同一制造商不同指标组分的含药量在限度要求之上变化无法直接比较产品质量，因此，统计SHLO 中3 个药味的总含量以比较各样品质量差异，结果见图2D。8 个厂家SHLO 中代表性成分的总含药量为16.47～26.16 mg·mL-1，其中X 厂家含药量最高，Z 厂家最低，3 个成分中黄芩含药量占比明显高于其他药味，表明其对产品质量影响最大，国家标准以其作为关键质量控制指标具有一定的合理性。

3.3 质量一致性

依据2.5 项下描述的质量一致性评价方法统计不同厂家产品的质量一致性参数，结果见表4。8 个厂家的PA为1.2%～7.7%，除Z厂家外，各PA≤3.6%，表明这些厂家批内一致性质量控制水平良好；PB为16.6%～39.1%，反映出不同厂家间批间质量控制存在差别，其中F、R 厂家的PB＜20%，T、S、X 3 个厂家20%＜PB＜30%，Z、L、J 3个厂家30%＜PB＜40%；各厂家PC均≥99.3%，表明其内部样品整体相似度较高。

表4 8个厂家SHLO的质量一致性差异 %

3.4 PCA

以8 个厂家SHLO 的3 个一致性参数为变量进行性PCA 拟合，8 个厂家样本的PCA 得分散点图见图3，2 个主成分累积方差贡献率为88.7%，可以代表变量的大部分信息。

图3 8厂家SHLO的PCA得分

对3 个一致性参数提取新的主成分，分别设置为p1 和p2，两因子是不同样本的第一和第二分量矩阵得分，新生成的主成分因子的表达公式分别为p1=0.604×PA+0.745×PB-0.284×PC、p2=0.537×PA-0.116×PB+0.836×PC。两公式计算使用了成分矩阵的结果，有利于对不同样本进行评分。随后，以每个主成分的方差百分比作为权重，设置一致性区分因子（P），计算公式为P=0.504×p1+0.383×p2，各厂家得分结果见表5。根据分值可以将8个厂家分为3类，Z、L、J 3个厂家P值均大于30.0，分为一类；S、T、X 3个厂家25.0＜P＜30.0，分为一类；F、R 2个厂家P＜25.0，分为一类。由于P值越小一致性越好，该结果说明F 和R 2 个厂家产品一致性较好。

表5 8个厂家SHLO的主成分因子和一致性区分因子得分

4 讨论

为尽可能对所选择成分进行完全提取，本研究在样品前处理部分（提取溶剂、料液比、提取时间）进行了详尽的考察，为尽可能对各成分准确定量，将各成分在190～400 nm 扫描，发现连翘苷、黄芩苷和汉黄芩苷的最大吸收波长相差6 nm 以内，经综合考虑最终选取278 nm 作为此3 个成分的检测波长；新绿原酸、绿原酸及连翘酯苷A 的最大吸收波长相差4 nm 以内，故将330 nm 作为此3 个成分的检测波长；在定性部分预先设定6 个检测波长，比较不同波长下样品的色谱峰数量、峰形、分离度后选取254 nm 作为样品指纹图谱的检测波长。

定量指标中黄芩苷、连翘苷、绿原酸为《中国药典》2020 年版必检成分；新绿原酸作为绿原酸的同分异构体，有抗炎、增强免疫、心血管保护等作用[18]，且在金银花中含量较高；连翘酯苷A为连翘中主要活性成分，有抗炎、抗氧化、改善肺损伤的作用[19]；汉黄芩苷为黄芩中重要活性成分之一[20]，具有抗炎、缓解急性肺损伤的作用[21]，因此将此6个成分作为定量指标。《中国药典》2020 年版必检成分与非《中国药典》2020 年版规定成分相组合的方式，可以较真实地还原原料药味的真实性，从而避免药品质量唯《中国药典》2020 年版指标成分是重的绝对性。

由研究结果可知，《中国药典》2020 年版指标成分含量均合格且差异较小，非《中国药典》2020年版指标成分含量则存在较大差异。尤其是汉黄芩苷，分析样本产地发现，河南制造商（如F、T 和Z）生产的SHLO 样品中该成分质量浓度相对稳定，为0.20～0.40 mg·mL-1，而东北制造商（如R、S、L、X）生产的样品中汉黄芩苷质量浓度差异较大，为0.002 1～1.580 0 mg·mL-1，相差700 余倍。此结果值得笔者团队更加深入分析研究。各制造商生产的SHLO 产品PA差异较小（＜8%），说明各厂家生产工艺相对成熟，在保证每次投料饮片质量均一的情况下，产品批内质量一致性能得到较好的控制；PB远大于PA表明批间一致性控制较难，也说明原料质量差异是影响不同批次样品质量的重点。在中药制剂的生产过程中，中药材的质量差异会传递至处方药味、中间体及成品，直接影响中药制剂批间质量的稳定性。为减少此类原因导致的质量波动、提高中药制剂批间质量一致性，建议各生产厂家依据国家药品监督管理局药品评审中心2020 年发布的《中药均一化研究技术指导原则（试行）》[22]，以减少批间质量波动、达到质量均一为目标，在不改变投料量的前提下，对不同批次具有一定质量波动的合格处方药味采用合适的均一化投料的措施。根据P将厂家分为3 类，各厂家一致性（24.2≤P≤33.3）有差异但不明显，且R、F厂家产品质量均一性较其他产品更好。

药品是具有预防治疗疾病功能的特殊商品，质量好坏关系到用药人群的健康安全。本研究结果揭示了常见8 个厂家的SHLO 存在一定程度上的质量差异，此结果值得医药企业关注。该结果也反映出现阶段仅依靠国家、地方标准难以使药品质量均一稳定，期望更多的国家相关部门和专家同行一起关注中成药质量的一致性问题并提出解决办法，制定能体现药品品质的相关标准，共同推进中成药质量提升，保障中成药的质量安全稳定。

[利益冲突]本文不存在任何利益冲突。