鳗鱼骨酶解及美拉德反应制备优质风味物工艺研究

刘家光

（福建正味生物科技有限公司，福建 福州 350015）

0 引言

鳗鱼的营养价值非常高，被称作是水中软黄金，有“水中人参”之美誉[1,2]，2020年全国养殖鳗鱼高达25.07万t[3]。鳗鱼是福建重要的淡水养殖品种之一，其含肉率高，肉质细滑，多以烤鳗的形式出口，然而在烤鳗的工业化深加工过程中，会产生大量的边角料，如鳗鱼头、鳗鱼内脏、鳗鱼骨等[4]。欧洲鳗鱼的鱼骨占鳗鱼质量10%以上，是鳗鱼加工主要副产物之一[5,6]，但是，这些低值边角料蕴含着丰富的营养物质，特别鳗鱼骨是一种高级的营养食品，除蛋白质、氨基酸[7]和碳水化合物外，钙、磷、铁等多种无机盐的含量也很高，锌和硒含量相对较高[8]。然而，鳗鱼被取肉后剩下骨头又硬又锋利，很难被食用，只有部分被简单加工为骨粉添加到附加价值不高的普通鱼饲料中，多数鳗鱼骨头都被作为废弃物，这样既浪费资源又污染环境。

有效地对这些低值的鳗鱼下脚料进行精深加工并实现其高值化，是我们必须重视和解决的问题。鳗鱼骨可以加工成饲料鱼粉，提取胶原蛋白，提取可溶性钙，制成保健食品、调味品等。本研究利用生物复合酶解技术对鳗鱼骨进行酶解，将低值的鳗鱼骨下脚料处理加工成富含骨胶原、多肽及氨基酸等功能因子的提取物产品，将酶解产物进行美拉德反应，利用调配、真空浓缩等技术开发生产出口感风味俱佳的鳗鱼风味调味品。

本研究成果可以在餐饮、调味品、冷冻调理食品、香精、海鲜制品等领域作为安全的食品配料广泛应用，鳗鱼风味调味品是一种具有发展潜力和应用前景的食品添加剂，可以为鳗鱼下脚料的高值化利用提供参考，提高鳗鱼产业的经济效益。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜鳗鱼骨[胜田（福清）食品有限公司]；酶制剂（风味蛋白酶、复合蛋白酶）——夏盛(北京)生物科技开发有限公司；盐酸（济南佰科化工有限公司）；氢氧化钠（滨化集团股份有限公司）；木糖（河南万邦实业有限公司）。以上均符合相关产品卫生标准。

1.2 主要仪器与设备

LC-WB-4 恒温水浴锅(上海皓庄仪器有限公司)；TB-430振筛器(佛山市顺德区天博机械有限公司)；PH-100B酸度计上海力辰仪器科技有限公司；DT-200槽型混合机(上海力辰仪器科技有限公司)；JJ-2 FK-A型组织捣碎匀浆机(上海鑫翁科学仪器有限公司)；RE-201D旋转蒸发仪(上海耀特仪器设备有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 鳗鱼骨酶解提取物工艺流程

原料选择→清洗（去血水）→切断、捣碎→酶解→灭酶→过滤→真空浓缩→成品

1.3.2 鳗鱼骨酶解浓缩液加工工艺操作要点

1.3.1.1 原料的选择及预处理⑴ 原料的选择：选择新鲜的鳗鱼骨（欧洲鳗），天气热需放冷库低温冷藏，防止变质。

⑵ 预处理：新鲜的鳗鱼骨用流动水进行漂洗30 min去血水，切成2 cm的小段，放入捣碎机中搅碎备用。

1.3.3.2 鳗鱼骨酶解浓缩液的制备流程

根据之前的确定的酶解工艺制备鳗鱼骨酶解浓缩液。鳗鱼骨酶解浓缩液的酶解工艺参数为：蛋白酶质量为0.1%（复合蛋白酶和风味蛋白酶的质量比为1∶1）、料液比1∶1（g/mL）、酶解温度50 ℃、酶解时间5 h。酶解结束后将酶解液升温至96 ℃保持10 min灭去酶活性，60目过滤筛将酶解液滤出，除去酶解液的上层油脂，剩余骨渣丢弃。采用真空浓缩法（真空度-95 kPa，浓缩温度55 ℃），将得到的鳗鱼骨酶解液进行真空预处理，使其浓缩为原来体积的20%，从而获得鳗鱼骨酶解浓缩液。

1.3.3 美拉德反应改良工艺参数优化

⑴ 单因素试验

考察木糖添加量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）、反应温度（90、100、110、120、130 ℃）、反应时间（30、40、50、60、70 min）、pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）对美拉德反应改良鳗鱼骨酶解提取物风味模糊综合感官评分的影响。

⑵ 正交试验

根据单因素试验结果，以pH值（A）、反应时间（B）、反应温度（C）、木糖添加量加量（D）为主要因素为考察因素，选取模糊综合感官评分为指标，按L9(34)正交表进行试验，因素水平表见表1。

表1 美拉德反应改良鳗鱼骨酶解提取物风味优化正交试验设计因素水平表

1.3.4 感官评价方法

由有食品相关专业教育背景专业人员10人（5男5女）组成评定小组，为提高感官评价的可信度，在评定之前不得使用有气味的化妆品，1 h不得抽烟等。分别对美拉德反应改良鳗鱼骨酶解提取物的外观、滋味、气味及色泽进行等级评定，等级分为差、中、良、优四个等级，按百分制评分，感官质量评定标准见表2。

1.3.5 建立模糊综合感官评价模型

⑴ 因素集、评语集和加权重集的建立

因素集是影响被评价对象的指标集合，参照韩晓江等[9]的方法建立以外观(U1)、滋味(U2)、气味(U3)、色泽(U4)作为美拉德反应改良鳗鱼骨酶解提取物的评价指标的模糊综合感官评价模型，从而得到的因数集U={u1，u2，u3，u4}。

评语集是指参与美拉德反应改良鳗鱼骨酶解提取物感官质量的评价者对其评价反馈信息的集合，确定评语论域需要评定的等级。经过评定全体成员讨论，确定美拉德反应改良鳗鱼骨酶解提取物的评价等级为优(n1)、良(n2)、好(n3)、差(n4)，得到美拉德反应改良鳗鱼骨酶解提取物的评语集N=｛n1，n2，n3，n4｝。评价过程中差优、良、中和差4个等级分别赋予相应的分值90、80、70、60，则评价等级集K={K1，K2，K3，K4}={90，80，70，60}。

⑵ 确定权重集

根据谭沙等[10]的方法，权重是指评价因素对模糊数学评价的重要程度，表示为X=(x1，x2，x3，x4)，外观、滋味、气味及色泽是影响美拉德反应改良鳗鱼骨酶解提取物感官品质的指标。该试验采用强制规定法确定各因素的权重分别为外观(0.20)、滋味(0.35)、气味(0.30)、色泽(0.15)即权重集X=(0.20，0.35，0.30，0.15)。

⑶ 建立模糊综合感官评判

模糊感官综合评价结果为Yi=X×Ri（i为1-9），其中X为权重集，Ri为模糊矩阵；并引进综合评分矩阵T处理模糊关系评价集Y，得到美拉德反应改良鳗鱼骨酶解提取物样品的模糊综合评价总分T=Y×K，其中K={k1，k2，k3，k4}为评价等级集。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 木糖添加量对鳗鱼骨酶解液美拉德反应的影响

美拉德反应是食品风味产生的主要来源之一，还原糖添加量影响美拉德反应产物的色泽和香味。木糖反应活性较好，价格便宜，能促进目标物的甜味和焦糖香产生。

实验结果见图1，由图可知，添加1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%木糖进行美拉德反应，随着木糖添加量的增加，在波长280 nm与420 nm处的吸光度也随之增加。通过感官评分显示，当木糖添加量为2.0%时，其感官评分最高，木糖添加量超过2.0%之后感官评分开始下降，而木糖添加量超过2.0%时，焦糖化反应加剧，褐变急速加剧和产生焦苦味使感官评分降低。当木糖加入量增加，其反应速度加快，当添加量过多时其反应不彻底，而在感官上有明显的甜味和略带焦苦的味道，颜色偏深，因此从各个方面来看，确定最佳的木糖的添加量为2.0%。

图1 木糖添加量对美拉德反应产物感官评分的影响

2.1.2 反应温度对鳗鱼骨酶解液美拉德反应的影响

实验结果见图2，由图可知：在90、100、110、120、130 ℃的反应温度条件下进行美拉德反应，随着反应温度的升高，在波长280 nm与420 nm处吸光度随之增加，感官评分也逐渐增加，在110 ℃达到最高值；当反应温度达大于110 ℃时，低分子质量香味中间体含量较高，其感官评分逐步下降，280 nm处吸光度也随之下降，这可能是美拉德反应速度大幅提高，类黑精物质产生加速，掩盖了原有的海鲜风味[11,12]，并呈现出焦苦味，颜色呈褐色,对感官评分有不利影响,所以将110℃为最佳反应温度。

图2 反应温度对美拉德反应产物感官评分的影响

2.1.3 反应时间对鳗鱼骨酶解液美拉德反应的影响

实验结果见图3，由图可知在30、40、50、60、70 min的反应时间条件下进行美拉德反应，在波长280 nm和420 nm处的吸光度都与反应时间成正比，酶解液颜色也随之加深，这说明美拉德反应的程度也随着反应时间的延长而增强，这与董志俭等[13]和李学鹏[14]的研究结果相同。然而，感官评分逐步升高，当反应时间达到60 min时，美拉德反应产物的感官评分达到最高，反应产物的风味和质量最佳，但随着反应的持续进行，反应产物的褐变进一步增加，颜色也进一步变深，出现焦苦味较明显，风味不佳，分数下降。因此确定最佳的反应时间为50 min。

图3 反应时间对美拉德反应产物感官评分的影响

2.1.4 反应体系初始pH值对鳗鱼骨酶解液美拉德反应的影响

反应初始pH值对美拉德反应体系有着很大的影响，如氨基酸、肽类、蛋白质等含有的氨基和还原糖中的羰基，在不同的pH值下，形成离子化程度不一样，使其风味差异较大；在反应pH值过高的情况下，美拉德反应产物颜色变深，在感官上有一种焦糊味。

实验结果见图4，由图可知在反应pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的条件下进行美拉德反应，随着pH值的增加，酶解液的褐变颜色加深，美拉德反应的感官评分呈现先上升后下降的趋势。当反应pH值为7.0时，感官评分达到最大。在反应pH值为6.0～7.5的条件下，低分子质量的香味中间体增加；当反应pH＞7.5时，香味中间体含量下降。随着pH值的升高，鳗鱼骨酶解液会产生焦糊味，并使其颜色变深，使感官评分降低，结果显示pH值对美拉德反应产物的褐变程度有着很大的影响。因此确定最佳的反应体系初始pH值为7.0。

图4 初始pH值对美拉德反应产物感官评分的影响

2.2 模糊数学综合感官评价结果

通过评定小组感官评价员对9个美拉德反应改良鳗鱼骨酶解提取物样品的外观、滋味、气味及色泽4项指标进行评价，将评价结果收集汇总并进行统计分析，得出美拉德反应改良鳗鱼骨酶解提取物的感官评价结果见表3。

表3 不同配料下美拉德反应改良鳗鱼骨酶解提取物感官评价结果

2.3 模糊矩阵模型建立的结果

模糊矩阵是根据感官评价中各评语得票数比评价总人数，那么根据感官评价结果得到9个模糊矩阵Ri，其中i代表第i个样本。例如以1号样本为例，得到表4所示的感官评价结果，则样品1的矩阵为：

表4 美拉德反应改良鳗鱼骨酶解提取物优化正交试验结果与分析

同理可得R2-R9。采用先相乘再加和的方法计算综合评分，根据确定权重集X=(0.2，0.3，0.3，0.2)。对模糊感官的综合评定结果Yi=X×Ri（i为1-9）。例如以样品1为例，其模糊感官评价结果：

同理可得Y2-Y9样品的模糊数学感官综合评价结果。

模糊综合评价总分T=Y×K，Y1={0.42 0.27 0.15 0.17}，评价等级K={90，80，70，60}，因此第1个美拉德反应改良鳗鱼骨酶解提取物样品的模糊综合评分为：

同理可得2#—9#美拉德反应改良鳗鱼骨酶解提取物样品的模糊综合感官评价总分。

2.4 正交试验结果分析

在单因素试验以感官评分为评价指标的基础上，以反应体系初始pH值、反应时间、反应温度和木糖添加量4个因子，设计4因数3水平正交试验，试验结果如表4所示。

由表4正交试验极差分析可知，影响美拉德反应产物的感官评价各因素的主次关系：B反应时间＞C反应温度＞D木糖添加量＞A反应体系初始pH值，所以得到美拉德反应提取物的最优组合为A3B1C2D1，由于此组合不出现在正交试验结果表4中，所以需要进行验证试验。

2.5 验证试验

为了验证鳗鱼骨酶解液美拉德反应提取物工艺条件的稳定性，按最佳美拉德反应工艺条件A3B1C2D1，分别对这该组合进行3次试验，发现该组合的感官评分（89.25分）明显优于组合A3B1C3D2（85.75分）。所以得到的鳗鱼骨酶解液美拉德反应提取物最佳组合为A3B1C2D1，即反应初始pH值为7.5、反应时间50 min、反应温度120 ℃、木糖添加量1.5%。

2.6 鳗鱼酶解液水解度测定结果

对鳗鱼骨酶解液水解度进行分析测定，得出试样中蛋白质含量为9.22 g/100g，由此可得鳗鱼骨酶解液水解度为7.63%，氨基酸态氮含量为0.70 g/100mL。

3 结论

本研究以鳗鱼骨为主要原料进行蛋白酶水解，在酶解液中加入木糖并通过美拉德反应制备出具有鳗鱼风味的提取物产物，鳗鱼骨酶解液美拉德反应的工艺经单因素试验与正交试验相结合进行了优化，结果表明，优化后工艺条件为初始pH值7.5、时间50 min、温度120 ℃、木糖添加量1.5%，在此优化工艺制得的美拉德反应产物风味得到了较大改善，色泽呈棕褐色或棕黄色，烤鳗鱼滋味和焦香味浓郁，香气突出，没有其他不良异味。