作物耐低氮机制的研究进展

符晶晶 李佳佳 徐翎清 周国庆 刘大丽

摘要： 氮（N）是作物的主要营养来源，低氮会限制作物的生长和产量，而过多的氮肥施用虽然在一定程度上能够提高作物产量，但也会造成氮肥利用效率低及资源浪费。开发具有较高的低氮（LN）耐受性或氮利用效率（NUE）的作物品种，对于农业可持续发展至关重要。本文主要从作物对氮的吸收、低氮对作物生长和作物产量的影响、作物对低氮环境的适应机制、耐低氮基因型筛选、氮高效基因的研究进展5个方面综述作物对低氮的应答机理。耐低氮基因型作物主要通过改变根部性状（如更多侧根、增大根表面积等），调控相关的代谢酶（如硝酸还原酶、谷氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶）及褪黑素等表型和生理活动调节，以改变其代谢所需能量，从而适应低氮胁迫。此外，QTL定位、转录组学、全基因组关联分析等挖掘出一系列与氮高效利用相关的基因（如  OsNIGT1、GLN1.3、NRT1.1、ZmNAC36、BnaA04g07450  等），为进一步作物耐低氮分子育种提供理论参考。

关键词： 低氮胁迫；适应机制；基因型；耐低氮基因；氮利用效率

中图分类号：S184  文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2024）02-0011-07

氮（nitrogen，N）不仅是蛋白质、核酸和磷脂等细胞组分的主要成分，还是作物生长最重要的营养物质之一［1］。同时，氮是叶绿素的重要组成部分，氮素含量与光合作用密切相关［2］。因此，缺氮会影响作物的一系列生理活动和表型，最终导致作物的生物量下降［3］。人们试图通过大量施氮肥来提高作物产量，但研究表明，仅有30%～40%的氮素被利用［4］，未被吸收的氮以土壤侵蚀、微生物利用、氮淋溶、氮挥发、硝化等方式流失，并引发严重的环境问题［5］。因此，如何降低氮素使用量并提高作物的氮利用效率（nitrogen use efficiency，NUE），是目前亟待解决的问题。

1 作物对氮的吸收利用

作物能够从土壤中吸收无机氮和有机氮。无机氮包括铵盐和硝酸盐，它們是作物氮素吸收的主要形式，可被同化为氨基酸，如谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺等；有机氮则主要包括氨基酸、多肽、蛋白质等［6-7］。

1.1 硝态氮的吸收与同化

硝态氮是土壤中无机氮的主要存在形式［8］。作物根系从土壤中吸收硝态氮，受硝酸盐转运蛋白调控，这些转运蛋白主要是NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2等NRT家族蛋白［9］。硝酸盐被根系吸收后，可以贮存在细胞的液泡中，或者被根表皮和皮层细胞同化。多余的硝酸盐通过木质部导管输送到叶肉细胞，并在叶肉细胞的液泡中暂时储存。硝态氮还原为铵，需要2个连续反应：首先，NO-3在细胞质中被硝酸还原酶（nitrate reductase，NR）还原成亚硝酸盐；然后，亚硝酸盐再通过亚硝酸还原酶（nitrite reductase，NiR）在叶绿体中进一步还原成NH+4，由此形成氨基酸［10］，进而在作物体内发挥功能。

1.2 铵态氮的吸收与同化

作物对铵态氮的吸收主要通过铵转运蛋白（ammonium transporters，AMTs）来完成。铵转运蛋白（AMTs）包括 AMT1、AMT2这2个家族［11］。例如，水稻是被鉴定出含铵转运蛋白基因最多的植物种属，发现4个亚类包括 10 个铵转运蛋白基因：  OsAMT1 1、OsAMT1 2、OsAMT1 3、OsAMT2 1、OsAMT2 2、OsAMT2 3、OsAMT3 1、OsAMT3 2、OsAMT3 3、OsAMT4  ［12］。AMTs也可被划分为高亲和转运蛋白、低亲和转运蛋白2种类型；其中AMT1属于高亲和铵盐转运蛋白，主要负责植物根中铵盐的吸 收［13］。研究发现，水稻中编码   OsAMT1 1、OsAMT1 2、 OsAMT1 3   的基因主要在根中表达，在低氮和中氮水平下，  OsAMT1 3   基因在氮低效型品种中的表达量低于氮高效型品种［14］。在苜蓿、小麦、水稻等作物中，均鉴定出AMTs基因［15］。铵盐的同化可以通过光呼吸作用发生在根或茎中［16］。 铵在叶片或根中通过谷氨酰胺合成酶（glutamine synthase，GS）- 谷氨酸合成酶（glutamate synthase，GOGAT）途径结合到有机分子中［17］，产生多种氨基酸，在作物的氮代谢过程中发挥作用。NH+4在GS 的作用下结合谷氨酸并消耗1分子ATP生成谷氨酰胺（glutamine，Gln）；Gln可刺激GOGAT活性，从而将谷氨酰胺的酰基基团转给α-酮戊二酸，产生2分子谷氨酸（glutamic acid，Glu）。当铵态氮同化形成Glu或Gln后， 会通过氨基酸转移酶反应，形成其他各种氨基酸［18］，在作物抗性方面发挥相应作用。

2 低氮对作物生长和作物产量的影响

一般情况下，低氮营养会导致作物生长缓慢、叶绿素合成降低，从而造成叶片变黄、植株矮小、产量下降［19］。研究表明，低氮环境可抑制小麦、玉米的生长，导致作物植株矮小、分蘖较少、产量下降［20-21］。由于作物在繁殖期主要以开花、结实为主要特征，而氮缺乏则会使其过早衰老、生长迟缓，出现茎干变薄、矮化、木质化等现象，从而影响结实和生物量积累。在辣椒成熟期，如果降低氮的供应量，会显著降低果实中的氮含量和干物质积累量，最终导致减产［22］。因此，氮的供给情况直接关系到作物的表型、产量和品质［23］。

低氮会降低作物的光合作用和叶面积。在生育期低氮逆境下，作物叶片中的氮含量、光合酶类及类囊体中的氮含量下降，进而影响植株的光合作用。在低氮胁迫环境下，水稻和菠菜的叶绿素含量会明显降低，叶片的光合作用也会降低［24-25］。此外，低氮胁迫还会造成作物叶绿素PSⅡ光化学属性的变化［26］，而作物产量与光能吸收率、光能利用率之间存在很大的相关性，因此光合作用减弱会造成产量下降［27］。由于叶中氮和叶绿素之间存在着较强的相关性，故可通过增加叶中氮含量来提高叶绿素含量，进而促进作物的光合作用［23］。总的来说，氮素供应不合理，会对作物的生长发育、产量形成和质量产生严重的影响。

3 作物对低氮环境的适应机制

根是作物吸收养分和水分最重要的器官，在增强作物对胁迫的适应能力方面发挥着重要作用。研究表明，低氮环境会对作物根系形态造成明显的影响，作物根系会随着环境中氮含量的变化而进行适应性的调整，比如改变根系的长度、增加不定根及根毛数量等［28］。一般情况下，低氮环境会促进根系相对生长量的增加，侧根增多，直径降低，主根伸长，以有效扩大根系与土壤环境的接触面积，进而提高对氮素营养的吸收量。在低氮胁迫下，养分会优先向根部分配，抑制地上部的生长，从而使根冠比明显提高［29］。在不同的作物中，根部结构对低氮胁迫的反应是不一样的。例如，在低氮供应条件下，大豆的主根会显著变短［30］，而水稻根系显著变长［31］，玉米在低氮胁迫下，其根系长度、表面积及侧根数均增加［32］。研究发现，在低氮胁迫下，氮高效利用型玉米自交系的平均根长、总根长、侧根密度的数值都比氮低效利用型玉米自交系大［33］，这也说明根的构型重建对作物氮素的吸收与利用起着重要作用。

氨基酸大量存在于作物葉片中，其代谢产生的能量用于促进作物生长。通常认为，作物长时间处于低氮条件下，会使体内氨基酸的累积量减少［34-35］。某些氨基酸可以缓解非生物胁迫［36］。Schlüter等发现，在低氮胁迫下，玉米叶片中氨基酸同化下降，导致苹果酸含量不断降低，从而减少低氮对作物的伤害［37］。作物在低氮胁迫下会产生相应的适应机制。Li等研究发现，野生大豆对氮素的抗性主要表现在提高三羧酸循环，合成关键氨基酸，积累可溶性糖类、有机酸等代谢物，并形成有益的次级代谢物等方面［38］。Liu等对谷子苗期的低氮耐受性进行研究，结果显示在低氮胁迫下，耐低氮谷子品种的叶绿素含量及硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶、葡萄糖脱氢酶活性等指标都比不耐低氮品种的高［39］。Zhang等以氮高效、氮低效2种大白菜为试验对象，通过高通量RNA-seq技术，对它们受氮素调控后的全基因组基因表达模式进行比较分析，结果表明，2种植株的叶绿素（chlorophyll，Chl）含量及净光合速率（net photosynthetic rate，Pn）无明显差异，但硝酸盐运输、生长素合成及谷氨酸脱氢酶合成等关键基因的表达量有显著不同［40］。其他代谢酶在低氮环境下也起着重要的作用。在氮素供应不足时，莽草酯类代谢途径关键酶和苯丙烷类化合物合成关键酶基因同时被激活［41］，褪黑素也被发现可参与调控低氮胁迫下氮素的代谢过程［42］。此外，亚硝酸盐还原酶、叶绿体谷氨酰胺合成酶、铁氧还蛋白依赖性谷氨酸合成酶、天冬酰胺合成酶在大麦低氮耐受功能中发挥重要作用［43］。

总之，作物能够感受外界低氮环境，并利用自身的根系结构等表型改变以及体内的相关调节物质来适应低氮环境。

4 作物耐低氮基因型筛选

可通过筛选和创制耐低氮品种的方式，来解决农田氮肥利用效率低下的问题，实现环保和氮素高效利用。在低氮环境中，耐低氮基因型作物的产量、NUE与其他品种有明显差异。它们的根系生长势强，可以吸收尽可能多的氮素，供给地上部合成光合产物，再将光合产物分别输送到其他组织［44-45］。构建耐低氮评价体系，可以高效筛选不同类型的耐低氮作物。陈二影等认为，不同谷子品种在苗期氮素利用效率上存在明显差别，将79个基因型按2种氮素水平的干物质利用效率分为双高、双低、高氮高效、低氮高效4个类型［46］。陈凌等认为，在籽粒耐低氮能力评价体系中，通常采用穗粒质量、青草质量、氮素吸收速率作为评价的主要指标［47］。钟思荣等在低氮、常规氮供给条件下，利用茎叶氮积累与地上部干质量的相对数值，将烟草分为耐低氮基因型和氮敏感基因型［48］。Muchow研究发现，生物量、氮素含量、产量等性状与氮素利用率之间存在显著的相关关系［49］。刘秋员等以长江中下游地区的水稻为研究对象，通过建立水稻氮素生理利用效率、氮肥回收效率、籽粒产量效率、氮肥农业利用效率等指标［50］，采用熵加权的方法，对水稻氮素利用效率进行综合评估，建立水稻氮素高效类型评估系统［51］。

在氮素高效评估系统中，氮素吸收率、氮素利用率等是主要指标，可据其将作物划分为不同的基因型，划分好的耐低氮基因型可为氮高效育种缩短选种时间。关于氮素高效品种基因筛选的研究还较少，仍须深入研究以期为氮高效育种打好基础。

5 作物耐低氮基因资源的挖掘

利用遗传改良技术，培育低氮高效的作物新品种，已成为当前农作物氮素利用研究的热点。实施基因工程最关键的是对功能基因的挖掘。

5.1 QTL定位

连锁分析（linkage analysis），也称为QTL（quantitative trait loci）定位，是指利用与QTLs连锁的分子标记构建遗传连锁图谱，定位目标QTL在染色体上的位置和互作效应［52-53］。在这些数据中，构建连锁图谱是QTL定位的基础，分子标记覆盖度和群体遗传多样性会对连锁分析结果产生直接影响［54］。在大麦的QTL研究中，以品种Baudin、CN4079构建的RIL群体为材料，设置不同的氮浓度进行大田试验，对其表型及QTL定位，发现在2H、3H、5H、6H、7H染色体上控制大麦性状的24个QTLs，其中包括14个低氮特异表达的QTLs［55］。在玉米中，利用低氮胁迫相关的重要农艺性状的212个数量性状位点进行Meta分析，确定21个与低氮耐受性显著相关的共识QTLs （consensus QTL，cQTL）［56］。为了开发同时具有耐低氮性和耐干旱性的水稻，Feng等通过分离失真法和全基因组关联研究，在水稻的3组性状特异性渐进系中鉴定了79个DT-QTLs和387个LNT-QTLs；通过试验分析，得到4个符合预期的株系（PL6、PL36、PL50、PL66）存在重要等位基因，且表现出较强的干旱和低氮耐受性［57］，为水稻复杂的数量性状育种提供了理论依据。在水稻氮高效QTL上也取得研究进展，研究者在高氮和低氮条件下培养水稻品种F67、OM68杂交的重组自交系群体，QTL分析发现，2号、6号、11号染色体上存在同一个与氮高效利用率相关QTL［58］。QTL定位多应用于作物抗逆性基因的定位，为进一步的组学分析提供了路径。

5.2 转录组学的应用

伴随着测序技术的不断发展，RNA-seq已经成为转录组学分析的主要方法［59］。转录组学研究在深入挖掘新基因、发现低丰度基因、鉴定基因家族、确定代谢通路等方面，起着举足轻重的作用，被广泛应用于对作物的多种生物和非生物胁迫差异表达基因研究中［60］。

张婷婷等利用氮高效马铃薯品种冀张薯12号和氮低效马铃薯品种尤佳70，通过30 d低氮处理、转录组测序和差异基因分析，发现在低氮条件下，冀张薯12号根和叶中GS基因上调，而尤佳70号GS、GOGAT基因却下调，推测GS、GOGAT基因与氮高效利用有关［61］。为了探究高氮利用率的分子机制，中国科学院研究人员对比分析小麦高氮利用率品种KN9204和低氮利用率品种Jing411的基因组和转录组学数据，结果显示，缺氮抑制Jing411幼穗中细胞分裂相关基因的表达，从而使其对低氮敏感［62］。郭凯杰等发现，在低氮条件下，含氮素利用高效QTL的玉米SSSL10.04比亲本许178有更高的氮积累量，且地上部的氮利用率更高；KEGG分析结果表明，SSSL10.04在低氮条件下表现出更强烈的逆境适应调控，原因在于其根部有更多参与呼吸、抗氧化及氨基酸代谢的基因表达，而叶片则有更多参与抗氧化、作物激素合成及物质运输的基因表达［63］。丁庆倩等以谷子品种郑204为材料，利用高通量测序技术，筛选到1个在谷子根系和叶片中显著高表达的MYB家族转录因子  SiMYB42  ，该基因存在于细胞膜和细胞核中，可能通过调节NRT2.1、NRT2.4、NRT2.5等硝酸盐转运蛋白的表达，从而调控氮代谢过程，提高谷子对低氮胁迫的耐性［64］。在纤维作物棉花的研究中，薄义博以氮高效、低效2种类型的陆地棉为材料，通过7、14、21 d的低氮处理和转录组测序，发现显著差异的基因有433个；KEGG结果显示，2种陆地棉中差异基因主要集中在谷氨酸代谢、激素信号转导、类胡萝卜素生物合成等途径，在低氮胁迫下，GAD基因的表达在陆地棉中上调，在海岛棉中却下调，于是推测GAD基因的表达可能是导致2种棉花在低氮胁迫下存在差异的原因［65］。

5.3 全基因关联分析

全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）是一种对全基因组的遗传学研究，用来在自然群体中发现与性状相关的变化，是一种分析复杂性状解析的强大工具，已经被充分应用于水稻等作物中［66］。钱前院士团队以230份水稻为研究对象，结合转录组数据以及基因组测序数据进行全基因组关联分析，筛选到3个与氮高效相关的候选基因  OsNIGT1、LOC-Os05g45020、LOC-Os06g43090  ［67］。此外，全基因关联分析在芸薹属作物中的研究也较多。在对304份不同甘蓝型油菜种质进行的SNP 基因分型和全基因组关联分析中，发现11个单核苷酸的多态性与3个低氮耐受性状相关，并在这些SNPs附近发现3个重要基因（  GLN1.3、 NRT1.1、NRT1.6  ）［68］。在作物根系的研究中，Wang等通过GWAS和转录组测序发现玉米根系的耐低氮基因；该试验选用213份玉米自交系，在低氮和正常氮条件下培养，测定玉米的22个根系性状的自然变异，然后进行转录组测序和全基因组关联分析，筛選出候选基因  ZmNAC36  ，并对其进行重测序验证，发现该基因在根系耐低氮方面发挥重要作用［69］。对304份油菜苗期进行高氮和低氮处理，采用60kSNP对304 份油菜进行基因分型，发现3个候选基因（  BnaA04g07450、BnaA07g09690、BnaA09g47380  ） 与耐低氮性状相关，推测这3个候选基因与耐低氮有关［68］。以上研究为低氮耐受性的遗传调控提供了有价值的信息，可用于作物低氮耐受性的标记育种研究。

6 氮高效基因研究进展

随着生物技术的不断发展和创新，现代育种学者利用基因组学技术在作物中挖掘到多种与氮利用效率相关的基因，为氮高效育种提供更多可能。近年来，水稻全基因组序列逐渐完善，氮高效基因的全基因组关联分析成为水稻研究的热点。Wang等发现，水稻抽穗期7（heading date7，  Ghd7  ）基因能够与NUE负调控因子ABC1 ressor1 （  ARE1  ） 结合，抑制  ARE1  基因的表达，从而提高水稻的氮肥利用效率［70-71］。研究人员还发现，基因  OsNRT1.1A  在 水稻中的过表达大大提高氮素利用率［72］。关于水稻氮高效基因的研究进展还有很多，比如  OsNPF7.3、 OsNPF7.7  基因的高表达可以提高水稻的氮素利用率［73-74］。日本研究人员对119份水稻进行转录组测序，在低氮条件下，鉴定出4个重要的转录调控因子  OsHHO3、OsHHO4、OsRLI1、OsbZIP11，  是氮缺乏反应的关键调控因子，它们可能起到抑制转录因子的作用，从而提高水稻对氮素的利用率［75］。除了水稻，其他作物氮高效基因研究也在同时进行。范文静通过对129份甘薯品种进行低氮和高氮处理，分析甘薯的11种农艺形状并进行QTL定位和全基因组关联分析，发现与氮高效利用相关的6个候选基因  itfo1go8120.t1、itf01g22030.t1、itf01g22080.t2、itf01g22100.t2、itf01g22400.t1、itf01g25900.t1  ［76］。Gao等对氮高效甘蔗品种ROC22进行低氮处理，收集低氮处理后甘蔗根的miRNA数据库，通过GO、KEGG分析，发现低氮处理下  miR156  的过表达显著高于野生型，关键基因  NRT1.1、NR1、NIR1、GS的表达量也高于野生型，推测关键基因NRT1.1、NR1、NIR1、GS  可能与氮高效利用有关［77］。在小麦的氮高效研究中，通过定点编辑基因  TaARE1  来提高小麦对土壤氮素的吸收［78］。作物氮高效的研究目前已取得显著进展，但仍须继续探索，以期为氮高效分子育种提供更多的候选基因位点，创制优异新品种。

7 展望

培育具有高氮素利用率和耐低氮的作物品种，是降低生产成本、降低碳排放量、缓解因过度施用氮素而带来的生态问题的重要途径。作物对氮的吸收与利用是一个复杂的过程。目前，对低氮环境下作物的氮高效利用和胁迫耐受的多分子协同调控机理的认识还不够深入。未来的研究重点可以从以下3个方面展开：（1） 作物耐低氮和氮高效利用的分子机制和关键基因挖掘；（2） 通过基因编辑技术改良作物的低氮耐受能力，提高氮利用效率；（3） 低氮耐受和氮高效利用品种的开发与精确的田间管理和栽培技术相结合，最大限度地开发新品种的生物潜力。

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收 稿日期：2023-03-29

基金项目：国家糖料产业技术体系项目（编号：CARS-170102）；黑龙江省自然科学基金（编号：LH2023C090）；甜菜种质资源安全保存项目（编号：19230841）；甜菜种质资源精准鉴定项目（编号：19230709）；普查甜菜资源繁种编目入库项目（编号：19230801）；黑龙江省普通本科高等学校青年创新人才培养计划（编号：UNPYSCT-2020014）。

作者简介：符晶晶（1999—），女，贵州铜仁人，硕士研究生，研究方向为农艺与种业。E-mail：1579776359@qq.com。

通信作者：刘大丽，博士，副研究员，研究方向为作物分子生物学。E-mail：daliliu_hlju@163.com。