用于评价动物社交偏好程度的新方法

伍永鸿 奠雅雯 张天睿 欧文静 黄喜燕 张明倩 崔 爽 梁五林 张硕峰

(北京中医药大学中药学院,北京,102488)

社交行为障碍是许多神经发育障碍和精神疾病的典型特征,表现为与人交往时(尤其是大众场合下),会不由自主地感到紧张、害怕,以致手足无措、语无伦次,严重的甚至害怕见人,称为社交恐惧症、人际恐怖症[1],并常出现于注意力缺陷多动障碍(Attention Deficit Hyperactivity Disorder,ADHD)、抑郁症、自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder,ASD)等疾病[2]。因此,社交行为的变化就成了判断精神疾病的标准之一。社交行为亦存在于动物之间,为了在动物模型上研究社交行为的变化,科学家开发出了一系列的行为学实验,常见的包括嗅觉适应或不适应试验、钻管试验、食物偏好转变测试、社会偏好或逃避行为测试、三箱社交行为测试(Three-Chambered Social Test,TCT)等[3]。其中,TCT是评价动物社交行为最常用的实验方法,主要使用大鼠、小鼠,其原理是基于小鼠天生喜群居、对新物体具有探索倾向的特性[4],用于检测待测动物的社交探索行为、社交识别和社交趋新能力。但由于评价指标多为观察者主观记录,且观察时间较短,缺乏客观的技术参数,难以准确、客观地评价动物的社交程度。考虑到传统三箱实验的以上缺陷和不足,故研究者在其原来的基础上进行了改进,重新区域划分。本实验采用ADHD大鼠作为社交障碍模型,以WKY大鼠和Wistar大鼠作为对照组,模型动物采用治疗ADHD的临床常用中成药小儿黄龙颗粒进行治疗,以待测鼠在密切交流区域及有陌生鼠侧区域的时间、频次、路程及比例作为行为学指标,测试该装置与评价方法的可行性。

1 材料与方法

1.1 动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free,SPF)级自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats,SHR)24只,雄性,2周龄,体质量45～60 g;SPF级同源正常血压WKY大鼠8只,雄性,2周龄,体质量45～60 g;SPF级Wistar大鼠8只,雄性,2周龄,体质量45～60 g,均由斯贝福(北京)生物技术有限公司[许可证编号:SCXK(京)2019-0010]提供。动物合格证号:SHR:110324211105414141、11032411106224726,WKY大鼠:110011211111739136、110011211113633112,Wistar大鼠:11032411105414438、110324211106224824。室温(23±2)℃,相对湿度为65%±5%,给药前使动物先适应性饲养2 d,自由摄取食水,并且实验过程中对动物的操作符合医学动物伦理学标准(动物实验伦理审批号:BUCM-4-2022110801-4028)。

1.2 药物 小儿黄龙颗粒:由重庆希尔安药业有限公司生产,规格5 g/袋,批号:201002。小儿黄龙颗粒临床人用量为6～9岁,1袋/次,2次/d;10～14岁,2袋/次,2次/d。按12岁体质量32 kg计算,人用量为5 g/32 kg=0.156 25 g/kg。大鼠低剂量用药量按照人用量的6倍计算,2袋/d,即1.88 g/kg;大鼠高剂量用药量按照人用量的12倍计算,2袋/d,即3.75 g/kg。

1.3 仪器 AR1140/C型电子分析天平,奥豪斯(上海)公司产品;Ethovision XT 9.0型动物行为跟踪仪(荷兰Noldus公司);新三箱社交装置。

1)立体空间结构图,装置的空间结构见图1。其外侧为透明的立方结构(44 cm×44 cm×44 cm),内部由中间塑料板和前侧塑料板(其塑料板均不透明)以及里侧铁丝网将该装置划分为5个不同的腔室,其各腔室位置和所占区域大小图中已标明。实验时,待测动物由入口处进入通道区域1,并可经自由选择随机进入区域2或区域3。铁丝网内侧区域被均分为区域4和区域5,作为空白区域和陌生鼠区域。实验期间,陌生鼠被随机放置在区域4或5,另一侧区域作为空白区域;待测动物可在区域1、2、3内自由活动,并能通过铁丝网与陌生鼠进行嗅、靠近、接触等社交行为。

图1 新三箱装置立体空间结构

2)俯视区域划分,利用EthoVision XT 9.0软件对动物社交行为进行分析时,对采集到的画面进行区域划分。见图2。首先,将通道区域1标记为K区域,并将区域2、3均分为a、b和A、B区域。b、B区域为靠近铁丝网和内侧陌生鼠的区域,待测动物在该区域可与陌生鼠之间发生频繁接触、靠近、攀附铁丝网(企图靠近)等亲密行为,故可视为待测鼠与陌生鼠的密切交流区域,而a、A区域距离内侧陌生鼠和空白区域均较远,动物间的交流减少,通过对交流密切区域和交流稀疏区域的划分,可以反映动物的真实社交程度,达到对动物社交行为的精确量化与系统评价。最后,将区域4、5在镜头下所形成的区域标记为C、D区域,作为陌生鼠区域和空白区域,实验时将陌生鼠随机放入C区域。数据统计时,以a+b、b表示有陌生鼠侧区域和密切交流区域,其对应空白侧的区域分别为A+B、B,基于以上区域划分,对动物社交行为进行系统分析。

图2 新三箱装置俯视区域划分

1.4 方法

1.4.1 分组 将SHR按体质量随机分为3组,每组8只,即SHR组、小儿黄龙颗粒1.88 g/kg组、小儿黄龙颗粒3.75 g/kg组,另设WKY大鼠组、Wistar大鼠组作为对照,6只雄性、体质量相似的Wistar大鼠作为社交实验的陌生鼠。

1.4.2 给药方法 各给药物均按1 mL/100 g体质量灌胃给药,给药组灌胃用生理盐水配成的小儿黄龙颗粒溶液,SHR组、WKY大鼠组、Wistar大鼠组灌喂生理盐水,1次/d,灌胃时间为早上9:00,连续给药16 d。

1.4.3 检测方法与指标 在给药期结束后的第1天进行社交偏好实验,每组选取1只进行平行实验,每次4只。实验时,先在铁丝网内侧的C或D区域随机放入1只陌生鼠,将待测鼠由入口处放入所改进的三箱实验装置中,使其首先适应环境1 min,再观察30 min,所得视频文件用Noldus动物行为跟踪仪Ethovision XT 9.0进行分析。每做完1组后,将鼠取出归笼,清理装置内的尿液和粪便,并用乙醇擦拭,消除残余气体,再进行下1组测试。检测指标:1)区域交流时间,待测动物在区域b、区域a+b所待时间,以及不同区域的时间百分比,包括:a+b/A+B、b/B、b/a。2)区域运动路程,待测动物在区域b、区域a+b所运动的路程,以及不同区域的路程百分比,包括:a+b/A+B、b/B、b/a。3)区域进出频次,待测动物进出区域b、区域a+b的频次,以及不同区域的频次百分比,包括:a+b/A+B、b/B、b/a。

1.5 统计学方法 采用IBM SPSS Statistics 20统计软件处理,所有计量数据以均值表示,各组计量数据先进行正态检验和方差齐性检验,凡符合正态分布和方差齐性的数据,采用单因素方差分析,多组间两两比较采用LSD检验;对不符合正态分布和方差齐性的数据,则应用非参数检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 对幼年SHR社交时间的影响 通过统计待测鼠在改进的三箱装置中不同区域所待的时间及时间占比,检测到WKY大鼠与SHR对陌生鼠的社交偏好程度明显偏低,表现为在陌生鼠侧b区域、a+b区域所待时间显著降低(与Wistar大鼠组比较,P<0.01),不同区域所待的时间占比如a+b/A+B、b/B、b/a显著降低(与Wistar大鼠组比较,P<0.01)。小儿黄龙颗粒1.88 g/kg可显著增加SHR在b区域、a+b区域的所待时间以及a+b/A+B、b/B区域时间占比(与SHR组比较,P<0.05),并能提高b/a区域时间占比。小儿黄龙颗粒3.75 g/kg可不同程度增加SHR上述各指标数值,能明显增加大鼠在b区域、a+b区域的所待时间以及a+b/A+B区域时间占比。见表1。

表1 小儿黄龙颗粒对幼年SHR社交时间的影响

2.2 对幼年SHR社交移动距离的影响 通过统计待测鼠在所改进的三箱装置中不同区域所运动的路程及路程占比,检测到WKY大鼠区域运动路程比例b/a降低,其中在b区域、a+b区域所运动路程以及区域运动路程占比a+b/A+B、b/B显著降低(与Wistar大鼠组比较,P<0.01)。SHR组上述各项指标数值也降低,其中区域运动路程占比a+b/A+B、b/B显著降低(与Wistar大鼠组比较,P<0.01)。小儿黄龙颗粒2种剂量组均能不同程度地增加SHR上述各项指标数值,能明显增加模型大鼠在b区域、a+b区域的运动路程及a+b/A+B、b/B区域运动路程占比(与SHR组比较,P<0.05)。见表2。

表2 小儿黄龙颗粒对幼年SHR社交移动距离的影响

2.3 对幼年SHR社交频次的影响 通过统计待测鼠在所改进的三箱装置中不同区域的频次及频次占比,与Wistar大鼠组比较,WKY大鼠组在b区域、a+b区域的频次以及区域频次比例b/a、b/B降低,尤其是a+b/A+B区域频次比例显著降低(P<0.05)。SHR除了在a+b区域的频次略高于Wistar组大鼠外,其余各指标数值均降低。与SHR组比较,小儿黄龙颗粒1.88 g/kg组大鼠上述各指标数值均增加,尤其是在区域b、区域a+b的频次及区域频次比例b/a显著增加(P<0.05)。小儿黄龙颗粒3.75 g/kg组大鼠的区域频次比例b/a显著增加(P<0.05),其余上述各项指标数据均有不同程度的提高。见表3。

表3 小儿黄龙颗粒对幼年SHR社交频次的影响

3 讨论

社交行为障碍是许多神经发育障碍和精神疾病的典型特征,如ADHD、抑郁症、ASD等[5]。因此评价药物对实验动物社交行为的影响,是研发治疗这些疾病的新型药物和揭示社交障碍发生机制的重要研究手段。目前,常用的使用方法包括嗅觉适应或不适应试验、钻管试验、食物偏好转变测试、社会偏好或逃避行为测试、TCT等。其中TCT以其需要设备简单,易于操作最为常用[6]。但由于多数指标为观察者主观记录,且观察时间较短,缺乏客观的技术参数,难以准确、客观评价动物的社交情况。

本研究考虑到传统三箱社交实验的不足,在原来的空间基础上做了改进,重新划分了空间区域和设定了指标。其主要的设计思路和原理:1)传统三箱实验以中央室为起始区域,左右两侧分别为空白区域和陌生鼠区域,为长方形立体结构,但由于中央室两侧挡板的遮挡,待测动物在空白区域和陌生鼠区域中的视野暴露不完全,故在本装置中对其空间布局做了重新规划,将其改为矩形的立方结构,空白区域和陌生鼠区域由一块中央挡板隔开,处于整个观察区域的中央,无视野死角,并可以直接使用Noldus动物行为分析系统对动物的社交行为进行分析。2)本装置以区域a、b、A、B为指标统计的关键区域,其在摄像头下界限清晰,无视野盲区,通过Noldus动物行为分析系统能准确地统计待测鼠在各区域内的滞留时间、行走路程、出入频次、运动轨迹等指标。3)在进行区域划分时,将区域2、3分别均分为a、b区域和A、B区域,因为b、B为靠近铁丝网与陌生鼠的一侧区域,动物间的交流接触更加频繁,故作为交流密切区域,而相应的a、A区域则为交流稀疏区域,通过对交流密切区域和交流稀疏区域的划分,更能反映动物的真实社交情况。4)通过a、b区域的划分,统计动物在这2区域的出入频次、滞留时间、行走路程等指标,可以得到动物在局部区域和整体区域的社交情况;整个装置划分为a+b、A+B、K3个大区域,待测鼠在有陌生鼠侧区域的滞留时间、行走路程及出入频次比例a+b/A+B值,以及在密切交流区域的滞留时间、行走路程及出入频次比例b/B值,可以评价动物的社交偏好程度;在有陌生鼠侧区域,b区域更加靠近陌生鼠,待测动物与陌生鼠之间交流密切,而a区域距陌生鼠较远,动物间交流减少,b区域和a区域各指标的b/a值可以反映动物的真实社交活动程度,从而做到更加系统、全面、客观地评价动物的社交偏好。5)传统三箱社交实验的适应环境时间为10 min,观察时间10 min,而在本实验中将观察时间增加到30 min,以保证待测动物能够与陌生鼠之间充分接触,自由选择社交或逃避,使结果能更加真实反映动物的社交偏好程度,增加结果的可靠性和减少偶然误差。

为了验证本实验方法的可行性,我们选择2周龄的SHR及同源的WKY大鼠、Wistar大鼠的进行测试。SHR起源于东京远交系Wistar大鼠,是OKAMOTO和AOKI[7]在1963年运用选择性近亲交配法培育的WKY大鼠的基础上,经过交叉培育而成,因其10周龄后出现高血压症状而得名,常用于高血压的研究。而4～10周龄的SHR具有活动异常活跃,易冲动,易怒,学习记忆能力差,注意力不集中等特点[8],与人类儿童注意力缺陷多动障碍的症状吻合,故而用于ADHD模型大鼠。行为学研究表明其具有较强的活跃性和冲动性,并且由于冲动、多动的特点,易于陌生鼠间产生摩擦,表现出较弱的社交偏好程度,符合社交障碍模型的条件[9]。ADHD俗称小儿多动症,是指儿童和青少年期以注意力缺陷、多动、冲动为主要行为特征的神经行为障碍性疾病[10],并常伴随学习与记忆障碍、品行异常、社交障碍等问题。与正常儿童比较,ADHD患儿更多地表现出焦虑、害羞、退缩,害怕与他人交流,从而影响社会功能的形成与发展[11]。ADHD儿童的社会功能损害发生率高达89.8%[12],在情感因素方面存在困难,例如动机延迟和情绪调节,是儿童社会技能问题的根本基础[13]。故本实验选取幼年SHR作为社交行为障碍的模型动物。SHR来源于WKY大鼠,其在10周龄后表现出高血压的症状[14],故在做降压实验时常采用正常血压的WKY大鼠作为SHR的天然对照;且因其比其他品系大鼠自主活动低,在旷场实验中总运动量下降,在水迷宫实验中易漂浮不动,故亦常作为ADHD模型SHR旷场实验时的对照动物[15]。WKY大鼠虽然源自Wistar大鼠,但由于采取了近交维持措施,该品系大鼠已经与原先的Wistar大鼠有了差别,常表现出抑郁样的特征,在行为学方面表现为主动回避行为增加、对新异物体识别能力低,与临床中抑郁患者兴趣降低、认知功能受损、求生欲下降的特点较为相符,故不适用于用来作为幼年SHR社交行为实验的对照大鼠[16]。由于SHR、WKY大鼠均源自Wistar品系大鼠,故本研究设Wistar大鼠组,亦作为对照,目的是为了增加与SHR社交障碍行为学特征的可比性,客观反映SHR社交偏好情况。

本研究结果显示,与Wistar大鼠组比较,WKY大鼠组与SHR组大鼠在b区域、a+b区域滞留的时间及时间比例均显著降低(P<0.01),且在a+b区域更偏向于待在a区域,二者与陌生鼠的交流时间均减少;从区域移动路程结果来看,由于考虑到WKY大鼠自主活动低、运动速度慢,SHR多动、运动速度快的因素,其对区域运动路程存在客观影响,故用区域运动路程占比更具合理性,而结果表明与Wistar大鼠组比较,2组大鼠在b区域、a+b区域两区域运动路程比例a+b/A+B、b/B均显著降低(P<0.01),说明WKY大鼠组与SHR组大鼠与陌生鼠交流均减少;同样,从区域频次分析,考虑到各组大鼠自主活动程度、运动速度的不同对区域频次的影响,此外若待测动物与陌生鼠接触时间短暂,则其出入区域频次则增多,故用区域频次占比结果来衡量动物的社交偏好程度更好,结果显示,WKY大鼠组与SHR组大鼠区域频次占比a+b/A+B、b/B,与Wistar大鼠组比较均减少,且在a+b区域里在b区域频次占比更小,2组均表现出较低的社交偏好。

研究结果提示,WKY大鼠组与SHR组大鼠均存在社交障碍,且2组差异不大,较难区分,符合实际情况;Wistar大鼠更适合作为SHR社交障碍行为学实验的对照动物。本实验方法能详细记录动物的社交行为,并且所选取的指标(b区域和a+b区域的时间、路程、频次及比例)能明显、客观、全面地反映不同组间的社交偏好差异,能够辨别社交障碍动物与社交正常动物。小儿黄龙颗粒为第一个由国家食品药品监督管理局批准的治疗ADHD的中成药[17],其方组成为熟地黄、白芍、麦冬、知母、五味子、煅龙骨、煅牡蛎、党参、石菖蒲、远志、桔梗。陈瑶[18]研究发现,ADHD患儿在使用6周小儿黄龙颗粒治疗后,口干咽燥、手足心热、盗汗、失眠多梦及大便秘结积分均显著降低;万源[19]发现小儿黄龙颗粒能改善多动不宁、神思涣散2项主症与手足心热、大便秘结2项次症,并且未发现不良反应。此外,在相关动物实验中,其能改善动物行为学障碍,减少动物多动、冲动等异常行为,促进学习记忆,并能增加SHR对陌生鼠的偏好程度,延长与陌生鼠的交流时间,改善SHR的社交障碍[20]。鉴于小儿黄龙颗粒在临床ADHD治疗方面有着良好的安全性与有效性,并能改善ADHD大鼠模型的社交障碍,故作为本实验的阳性药物。

研究表明,小儿黄龙颗粒可使SHR在b区域和a+b区域的时间、路程、频次及比例均有不同程度增加。提示,在本方法可以评价小儿黄龙颗粒对社交障碍大鼠模型的逆转作用,说明该方法能准确、系统捕捉动物的社交行为,对其社交偏好情况进行客观评价。

综上所述,该方法空间区域划分合理,不仅解决了传统三箱实验的视野遮挡问题,能够清晰观察到待测动物在关键区域的行为情况;并且动物的社交行为可直接使用行为分析系统进行分析,实验所选取的指标能将动物的社交行为精确量化,真实反映动物的社交偏好程度,区分社交障碍动物与社交正常动物。本实验还通过增加观察时间增强了结果的可靠性和减少偶然误差,同时也避免了以往社交实验人为记录的主观性,提高了实验效果。此外,相比于WKY大鼠,Wistar大鼠更适合作为ADHD模型动物SHR社交障碍行为学实验的对照动物。

利益冲突声明:无。