CPSF6在晚期非小细胞肺癌中的表达及与预后的关系

谢明珠 朱洪斌 朱楠 郑炎

摘要：目的  探討剪切及多聚腺苷酸化特异因子6（CPSF6）在晚期非小细胞肺癌中的表达情况及临床价值。方法  利用TIMER2.0分析CPSF6在各肿瘤组织及癌旁组织中的表达差异，TCGA数据库的可视化平台GEPIA评估CPSF6在泛癌症背景下对总生存期的影响，使用GEPIA2工具比较肺癌不同病理分期（Ⅰ～Ⅳ期）中的CPSF6表达情况，在线检索TCGA数据库中肺腺癌和肺鳞癌的数据集，并进行生存和预后分析。收集2018年1月-2020年3月我院收治的74例晚期非小细胞肺癌患者肿瘤组织以及20例正常肺组织进行CPSF6免疫组化检测，Kaplan-Meier生存分析评估CPSF6表达与晚期非小细胞肺癌患者无进展生存期和总生存期的关系，单因素和多因素分析评估CPSF6对肺癌患者预后的意义。结果  TIMER 2.0、TCGA数据库分析表明非小细胞肺癌患者肿瘤组织中CPSF6 mRNA水平高于癌旁组织（P＜0.05），CPSF6与多种癌症（包括肺腺癌）患者的预后不良有关。CPSF6在晚期非小细胞肺癌组织表达高于正常肺组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。CPSF6表达增高与肿瘤大小、淋巴结转移情况及临床分期相关。Kaplan-Meier生存曲线显示，晚期非小细胞肺癌患者CPSF6表达增高，无进展生存期和总生存期降低。单因素及多因素分析显示，CPSF6的表达水平、淋巴结转移和临床分期均可作为晚期非小细胞肺癌患者的独立预后因子（P＜0.05）。结论  CPSF6在晚期非小细胞肺癌组织中表达增高，可能在其预后中发挥重要作用。

关键词：剪切及多聚腺苷酸化特异因子6；非小细胞肺癌；免疫组化

中图分类号：R734.2                                文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.04.017

文章编号：1006-1959（2024）04-0095-07

Expression of CPSF6 in Advanced Non-small Cell Lung Cancer and its Relationship with Prognosis

XIE Ming-zhu1，ZHU Hong-bin1，ZHU Nan2，ZHENG Yan2

（Department of Respiratory Medicine1，Department of Pathology2，Chaohu Hospital of Anhui Medical University，

Hefei 238000，Anhui，China）

Abstract：Objective  To investigate the expression and clinical value of cleavage and polyadenylation specific factor 6 （CPSF6） in advanced non-small cell lung cancer.Methods  TIMER2.0 was used to analyze the expression differences of CPSF6 in tumor tissues and adjacent tissues. The visualization platform GEPIA of TCGA database was used to evaluate the effect of CPSF6 on overall survival in the context of pan-cancer. The GEPIA2 tool was used to compare the expression of CPSF6 in different pathological stages （stages Ⅰ-Ⅳ） of lung cancer. The data sets of lung adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma in TCGA database were retrieved online， and survival and prognosis analysis were performed. The tumor tissues of 74 patients with advanced non-small cell lung cancer admitted to our hospital from January 2018 to March 2020 and 20 lung tissues were collected for CPSF6 immunohistochemical detection. Kaplan-Meier survival analysis was used to evaluate the relationship between CPSF6 expression and progression-free survival and overall survival in patients with advanced non-small cell lung cancer. Univariate and multivariate analysis was used to evaluate the prognostic significance of CPSF6 in patients with lung cancer.Results  TIMER 2.0 and TCGA database analysis showed that the level of CPSF6 mRNA in tumor tissues of patients with non-small cell lung cancer was higher than that in adjacent tissues （P<0.05）. CPSF6 was associated with poor prognosis in patients with various cancers， including lung adenocarcinoma. The expression of CPSF6 in advanced non-small cell lung cancer was higher than that in lung tissue， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The increased expression of CPSF6 was correlated with tumor size， lymph node metastasis and clinical stage. Kaplan-Meier survival curve showed that CPSF6 expression was increased in patients with advanced non-small cell lung cancer， and progression-free survival and overall survival were decreased. Univariate and multivariate analysis showed that the expression level of CPSF6 protein， lymph node metastasis and clinical stage could be used as independent prognostic factors for patients with advanced non-small cell lung cancer （P<0.05）.Conclusion  CPSF6 is highly expressed in advanced non-small cell lung cancer tissues and may play an important role in its prognosis.

Key words：Cleavage and polyadenylation specific factor 6;Non-small cell lung cancer;Immunohistochemistry

肺癌（lung cancer）是癌症相关死亡的主要原因之一，全球每年报告180万病例和160万肺癌患者相关死亡病例[1]。肺癌的发病率和死亡率均比较高，其主要包括两种类型，第一种为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），第二种为小细胞肺癌（small cell carcinoma of the lung，SCLC）。前者占比高达85%，包括肺腺癌、肺鳞癌[2，3]等。目前，随着联合治疗（包括手术切除和全身化疗）以及靶向药物、免疫药物等的应用，NSCLC的治疗已经得到了改善[4，5]。然而，NSCLC患者的长期生存率仍较低。因此，有必要鉴定与NSCLC患者组织病理学特征和预后相关的新型肿瘤相关标志物，从而为患者的治疗和预后研究提供理论依据和思路。本研究前期通过TCGA数据库检索发现肺癌患者组织中剪切及多聚腺苷酸化特异因子6（cleavage and polyadenylation specific factor 6，CPSF6）mRNA表达水平与患者临床分期及生存时间明显相关，是参与肿瘤发生和进展的一种关键蛋白。相关文献已经证实CPSF6可以作为乳腺癌[6，7]、肝细胞癌[8-10]、胃癌[11]及食管鳞癌[12]等多种癌症的预后相关基因，但是CPSF6在NSCLC患者中发挥作用的临床价值尚未阐述清楚。因此，本研究拟探讨CPSF6与晚期NSCLC的临床病理参数和预后之间的关联。

1资料与方法

1.1生物信息學分析  利用TIMER2.0（http：//timer.comp-genomics.org/）分析CPSF6在各肿瘤组织及癌旁组织中的表达差异；采用肿瘤基因组计划（The Cancer Genome Atlas，TCGA）数据库的可视化平台GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/）评估CPSF6在泛癌症背景下对总生存期的影响；随后进一步使用GEPIA2工具比较肺癌不同病理分期（Ⅰ～Ⅳ期）中的CPSF6表达情况；在线检索TCGA数据库中肺腺癌和肺鳞癌的数据集，并进行生存和预后分析。

1.2一般资料  收集安徽医科大学附属巢湖医院2018年1月-2020年3月收治并经病理诊断确诊的74例晚期NSCLC患者的肿瘤组织标本，其中鳞癌患者43例，腺癌患者31例；男56例，女18例；年龄34～83岁，平均年龄（66.30±9.20）岁；高分化25例，中、低分化49例；Ⅲ期患者28例，Ⅳ期患者46例；无淋巴结受累的患者33例，转移至淋巴结的患者41例。另选取同期手术切除的20例良性肺部病变患者的正常肺组织手术标本，其中男12例，女8例，年龄32～74岁，平均年龄（51.20±11.70）岁。肺癌分期标准参照2017年美国癌症联合会和国际抗癌联盟（UICC）制定的第八版TNM分期标准。本研究已经获得安徽医科大学附属巢湖医院伦理委员会的批准（编号：KYXM-202212-016）。所有患者均对研究知情同意。

1.3纳入和排除标准  纳入标准：①初次诊断的患者，入院前未经过放疗、化疗及手术治疗等，经临床和病理诊断确诊为NSCLC；②TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期；③肺癌组织相关标本保存完整；④临床资料保存完整，病理分型、分期及随访信息完整。排除标准：①合并有其他肿瘤的患者；②继发性肿瘤；③随访失访或临床资料不全者。

1.4 CPSF6蛋白的检测

1.4.1操作步骤  采用免疫组织化学染色检测CPSF6蛋白在晚期NSCLC样本中的表达：经过常规脱蜡水化后的石蜡切片，先由pH6.0的柠檬酸钠抗原修复液进行抗原修复，然后使用PBS溶液冲洗，去除多余水分后，继而添加100 μl内源性过氧化物酶阻断剂，室温下孵育10 min；PBS溶液冲洗后，滴加100 μl抗兔CPSF6单克隆抗体（按1∶100稀释），室温下孵育60 min；PBS溶液冲洗，加100 μl酶标山羊抗兔IgG聚合物，室温下孵育30 min；经过冲洗，除去多余的PBS溶液后，添加100～200 μl新鲜配比的DAB显色液，孵育3～5 min，光镜观察染色结果；流动水冲洗，复染，脱水封片。

1.4.2免疫组化结果判读  由我院病理科经验丰富的两位病理诊断医师进行双盲阅片。CPSF6表达是基于染色强度和染色阳性的肺癌组织细胞数量两者进行评价。CPSF6染色阳性的肺癌组织细胞数量可分为0分：0～5%肺癌细胞；1分：6%～25%肺癌细胞；2分：26%～50%肺癌细胞；3分：51%～75%肺癌细胞；4分：76%～100%肺癌细胞；肺癌细胞染色强度可以分为0分：无染色；1分：淡黄色；2分：黄色至浅棕色；3分：棕色至棕褐色。二者的分值相加，总的分数小于6分即表示CPSF6低表达；大于6分即表示CPSF6高表达。

1.5观察指标  随诊方式采用门诊随诊、住院复查及电话随诊等，主要观察指标包括无进展生存期（progression-free survival，PFS）和总生存期（overall survival，OS）。PFS指自确诊开始至发现疾病进展的时间（依据影像学表现）；OS为自确诊开始至患者死亡的时间（失访者为最后随访时间；实验结束时存活患者，为随访结束日）。以月为单位，随访至2023年3月1日。另外比较所有研究对象的性别、年龄、肿瘤大小、临床分期、病理类型、分化程度、有无淋巴结转移、PFS及OS等，分析其CPSF6表达水平。

1.6统计学方法   研究数据采用SPSS 22.0统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以[n（%）]表示，采用？字2检验。选择Kaplan-Meier法进行生存分析，并行Log-rank检验；利用Cox比例风险回归模型进行多因素分析。P＜0.05表明差异有统计学意义。

2结果

2.1 NSCLC中CPSF6表达的公共数据库分析  对TIMER2.0数据库中泛癌症数据的分析表明，NSCLC患者肿瘤组织中CPSF6表达水平高于癌旁组织（P＜0.05），见图1A；CPSF6表达与多种癌症（包括肺腺癌）患者的预后不良有关，见图1B；NSCLC患者不同病理阶段（Ⅰ～Ⅳ期）CPSF6 mRNA的表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1C；进一步分析肺腺癌和肺鳞癌的数据集，其中肺腺癌数据集包含483例癌组织和347例癌旁正常组织，肺鳞癌数据集包含486例癌组织和338例癌旁正常组织，结果显示，在肺腺癌中，CPSF6 mRNA表达增高的患者OS较CPSF6 mRNA低表达的患者低（P＜0.05），存在不良预后，见图1D、图1E。

2.2 CPSF6在晚期NSCLC组织及正常肺组织中的表达情况  免疫组化染色结果显示，CPSF6主要位于肺癌细胞的细胞核上。74例患者中CPSF6表达增高占比63.51%（47/74），CPSF6低表达占比36.49%（27/74）。在正常的肺组织中，CPSF6均为低表达。晚期NSCLC组织中CPSF6的表达高于正常肺组织，差异有统计学意义（？字2=25.405，P＜0.05），见表1、图2～图5。

2.3 CPSF6的表达与晚期NSCLC患者临床病理特征的关系  CPSF6的表达水平与晚期NSCLC患者的肿瘤大小、淋巴结转移情况及临床分期相关程度较高（P＜0.05），但与病理类型、年龄、性别、肿瘤分化程度无关（P＞0.05），见表2。

2.4 CPSF6、各临床病理特征与NSCLC患者预后的關系  采用 Kaplan-Meier 法进行单因素分析，选择 Log-rank进行差异显著性检验，结果发现CPSF6表达增高的患者较CPSF6低表达的患者PFS及OS短，差异有统计学意义（P＜0.05）。此外，肿瘤分期程度越高、合并有淋巴结转移的患者PFS及OS均降低（P＜0.05）。患者年龄、性别、病理类型、肿瘤大小、分化程度和患者预后无关（P＞0.05），见表3，图6～图11。Cox比例风险回归模型多因素分析显示，CPSF6的表达水平、淋巴结转移和临床分期均是NSCLC患者PFS及OS的独立危险因素（P＜0.05）。

3讨论

NSCLC侵袭性强，属于恶性程度极高的肿瘤，其发病率及死亡率均处于恶性肿瘤的第1位[13]。提高NSCLC的早期诊断率是延长患者生存期的关键。本研究借助挖掘TIMER 2.0、TCGA数据库中的肺癌数据集，筛选出目标基因CPSF6，发现NSCLC患者肿瘤组织中CPSF6 mRNA的表达水平高于癌旁组织，与多种癌症患者的预后不良有关。相关研究证实，CPSF6在肿瘤的发生、发展中发挥着十分重要的作用。CPSF6在侵袭性乳腺癌中高度表达，并且是患者预后不良的临床相关标志物[6，7]；该蛋白表达增高在肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭中也起着至关重要的推动作用。分析转录组范围中的APA进程可以得知，CPSF6表达增高是保证细胞溶质黄素蛋白NQO1中的3′UTR近端poly（A）位点发挥作用的重要前提条件[8-10]；其次，CPSF6在胃癌中上调，敲低CPSF6可以导致胃癌细胞中基因的广泛3′UTR缩短，并且其可以抑制胃癌细胞的增殖速度，暗示了CPSF6针对胃癌的潜在治疗靶点[11]。CPSF6在食管鳞状细胞癌组织中同样升高，并且CPSF6表达增高与临床病理参数如临床分期和淋巴结转移相关。CPSF6表达增高的食管癌患者与低表达组的患者相比，总生存期明显降低，预后较差[12]。

CPSF6定位于人12号染色体上，也称为CFIm68，分子量为68 kDa，是RNA切割和聚腺苷酸化处理所需的切割因子Im（CFIm）复合物亚基之一[12]。CFIm复合物是替代聚腺苷酸化（APA）的关键调节因子，APA是一种RNA转录后机制，用于产生可变的3'非翻译区域（3'UTR），从而提高细胞的转录组复杂性[14，15]。相关研究表明[16-18]，APA在许多类型的肿瘤发生中起着关键作用，例如乳腺、肾脏、结肠、肝脏和肺部等部位的肿瘤。

本研究进一步通过免疫组化实验检测74例晚期NSCLC患者的病理标本，结果显示CPSF6蛋白在晚期NSCLC组织中主要呈现高表达，在正常肺组织中主要呈现低表达，推测其可能参与了NSCLC的发生及进展过程，这也与TCGA数据库分析结果相一致。另外，CPSF6表达上调与肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期具有相关性，其在肿瘤直径＞5 cm、临床分期为Ⅳ期、有淋巴结转移的患者中升高。Kaplan-Meier生存曲线显示，CPSF6表达增高提示患者预后不良（P＜0.05），这与其他学者研究CPSF6在食管鳞癌患者中的作用结果类似[12]。NSCLC早期症状不明显，患者在就诊时往往已经处于疾病晚期，错失外科手术的机会，导致其生存率低、预后差。Cox多因素回归分析显示，CPSF6蛋白高表达、淋巴结转移和临床分期均是影响患者预后的独立危险因素，其他研究人员在乳腺癌[6，7]和肝细胞癌[8，9]的研究中也发现了CPSF6是判断癌症患者预后不良的相关标志物。分析本研究数据，CPSF6表达增高促进晚期NSCLC患者肿瘤侵袭同时降低患者预后的作用明确，但具体生物学机制目前尚不清楚。最新的研究表明[8]，CPSF6在APA进程中作为前mRNA切割和多聚腺苷酸化处理的激活剂，将前mRNA成熟为功能性mRNA。同时已经证实APA有助于肺癌中蛋白质代谢和肿瘤细胞运输的协调。细胞增殖失调可归因于癌变过程中细胞凋亡的抑制，体外和体内实验表明，阻断CPSF6表达对肺腺癌细胞增殖有显著的抑制作用。该研究同样发现PI3K/AKT信号通路是肿瘤发生的重要机制，在许多人类癌症（包括肺腺癌）中经常失调，而CPSF6与PI3K/AKT通路之间存在密切的相关性。这也进一步提示了CPSF6在肺癌肿瘤机制中的潜在作用，与本研究中发现CPSF6表达增高与NSCLC预后较差相对应。

综上所述，CPSF6在晚期NSCLC组织中的表达高于正常肺组织，其高表达与临床分期、淋巴结转移及肿瘤大小相关。CPSF6表达增高是晚期NSCLC患者的独立风险因素，有助于预测晚期NSCLC患者的预后。

参考文献：

[1]Pan J，Huang Z，Lin H，et al.M7G-Related lncRNAs predict prognosis and regulate the immune microenvironment in lung squamous cell carcinoma[J].BMC Cancer，2022，22（1）：1132-1132.

[2]Herbst RS，Morgensztern D，Boshoff C.The biology and management of non-small cell lung cancer[J].Nature，2018，553（7689）：446-454.

[3]黃小明，杜野，林少明，等.呼吸道微生态对晚期非小细胞肺癌患者接受PD-1抑制剂单药治疗疗效影响的探索性研究[J].中国临床药理学与治疗学，2023，28（1）：66-74.

[4]Duma N，Santana-Davila R，Molina JR.Non-Small Cell Lung Cancer： Epidemiology， Screening，Diagnosis， and Treatment[J].Mayo Clin Proc，2019，94（8）：1623-1640.

[5]Rotoli D，Santana-Viera L，Ibba ML，et al.Advances in Oligonucleotide Aptamers for NSCLC Targeting[J].International Journal of Molecular Sciences，2020，21（17）：6075-6075.

[6]Wang BJ，Liu DC，Guo QY，et al.NUDT21 Suppresses Breast Cancer Tumorigenesis Through Regulating CPSF6 Expression[J].Cancer Management and Research，2020，12：3069-3078.

[7]陈枞，杜俊娴，蔡承哲，等.CPSF6调控Notch信号通路促进破骨细胞分化及乳腺癌骨转移[J].中国临床医学，2020，27（3）：422-427.

[8]Tan S，Zhang M，Shi X，et al.CPSF6 links alternative polyadenylation to metabolism adaption in hepatocellular carcinoma progression[J].J Exp Clin Cancer Res，2021，40（1）：85.

[9]Liu Y，Zou H，Xie Q，et al.Ribonucleic acid-binding protein CPSF6 promotes glycolysis and suppresses apoptosis in hepatocellular carcinoma cells by inhibiting the BTG2 expression[J].Biomed Eng Online，2021，20（1）：67.

[10]黄进，娄哲琦，朱勇.CPSF6在胶质母细胞瘤进展中的作用及相关调控机制研究[J].中国生物工程杂志，2022，42（9）：1-16.

[11]Shi X，Ding K，Zhao Q，et al.Suppression of CPSF6 Enhances Apoptosis Through Alternative Polyadenylation-Mediated Shortening of the VHL 3'UTR in Gastric Cancer Cells[J].Front Genet，2021，12：707644.

[12]Guo S，Wang G，Zhao Z，et al.Deregulated expression and subcellular localization of CPSF6， a circRNA-binding protein， promote malignant development of esophageal squamous cell carcinoma[J].Chin J Cancer Res，2022，34（1）：11-27.

[13]张武通，韩健康，张海莲.SCCAg、EGFR及NSE在非小细胞肺癌病情进展、预后预测中的价值[J].分子诊断与治疗杂志，2022，14（9）：1511-1514，1518.

[14]Zhang Y，Liu L，Qiu Q，et al.Alternative polyadenylation： methods， mechanism， function， and role in cancer[J].Journal of Experimental & Clinical Cancer Research，2021，40（1）：51-51.

[15]Yuan F，Hankey W，Wagner EJ，et al.Alternative polyadenylation of mRNA and its role in cancer[J].Genes & Diseases，2019，8（1）：61-72.

[16]Wang L，Hu X，Wang P，et al.Integrative 3' Untranslated Region-Based Model to Identify Patients with Low Risk of Axillary Lymph Node Metastasis in Operable Triple-Negative Breast Cancer[J].Oncologist，2019，24（1）：22-30.

[17]Xiang Y，Ye Y，Lou Y，et al.Comprehensive Characterization of Alternative Polyadenylation in Human Cancer[J].J Natl Cancer Inst，2018，110（4）：379-389.

[18]Zhang Y，Shen L，Shi Q，et al.Comprehensive Analysis of APA Events and Their Association With Tumor Microenvironment in Lung Adenocarcinoma[J].Front Genet，2021，12：645360-645360.

收稿日期：2023-03-22；修回日期：2023-04-06

编辑/成森