非聚焦超声生物学效应应用研究

代皓天 任涛

摘要：近年来，随着声动力疗法等新技术的兴起，非聚焦超声生物学效应在医学治疗方面的运用渐渐得到人们的关注。本文对非聚焦超声生物学效应在肿瘤治疗、打开人体免疫屏障、神经调节、创伤治疗等医学治疗方面的应用进行了综述，以期为非聚焦超声生物学效应转化为医学治疗应用提供参考。

关键词：非聚焦超声；肿瘤治疗；免疫屏障；经颅超声刺激；创伤治疗

中图分类号：R454.3                                 文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.04.033

文章编号：1006-1959（2024）04-0168-06

Research on the Application of Biological Effects of Non-focused Ultrasound

DAI Hao-tian，REN Tao

（Department of Respiratory and Clinical Care Medicine，Shanghai Sixth People's Hospital Affiliated

to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200233，China）

Abstract：In recent years， with the rise of new technologies such as sonodynamic therapy， the biological effects of non-focused ultrasound in medical treatment has gradually gained attention. This article reviews the application of biological effects of non-focused ultrasound in medical treatment such as tumor treatment， opening human immune barrier， neuromodulation， and trauma treatment， in order to provide a reference for the transformation of biological effects of non-focused ultrasound into medical treatment applications.

Key words：Non-focused ultrasound;Tumor treatment;Immune barrier;Transcranial ultrasound stimulation;Trauma treatment

超声波是一种频率高于20 000赫兹的声波，因其频率下限超过人的听觉上限而得名。在生物体内传播过程中，超声波既会受到机体组织结构的影响而产生不同类型的回波，也可能会对机体组织的功能和结构产生不同程度的影响。后者被称为超声的生物学效应，是超声应用于医学治疗的理论基础。自1950年代首次应用于医学以来，超声已从传感和诊断工具发展为具有广泛应用的治疗工具，例如调节组织电生理、打开人体免疫屏障、药物输送和组织消融。超声分为聚焦超声（focused ultrasound，FUS）和非聚焦超声（unfocused ultrasound/non-focused ultrasound，UFUS/NFUS）。据报道[1]，聚焦超声，尤其是高强度聚焦超声（high intensity focused ultrasound，HIFU）作为新兴非侵入性治疗手段，在实体肿瘤治疗方面大放异彩，而非聚焦超声生物学效应在医学治疗方面的运用也渐渐得到人们的关注。本文对近年来国内外有关UFUS生物学效应有关的研究进行了分析，综述相关方法的原理及应用情况，以期为UFUS生物学效应转化为医学治疗应用提供参考。

1肿瘤治疗

近年来，随着HIFU等非诊断性超声技术的发展，人们开始关注非诊断性超声的治疗效果，UFUS肿瘤治疗的研究也日益增多。以前认为UFUS对肿瘤治疗作用主要是通过超声热效应，例如Samarbakhsh A等[2]报道了温和的超声热效应可以选择性地破坏快速分裂的细胞，阻止恶性脑肿瘤中的过度有丝分裂。声动力疗法（Sonodynamic therapy， SDT）是一种较新的微创抗肿瘤疗法，涉及化学声敏剂和UFUS。通过应用声敏剂，UFUS干扰癌细胞功能的机制能得到进一步放大，并且联用多种化学声敏剂将产生显著的协同效应，可以有效地破坏肿瘤生长，诱导细胞死亡，引发免疫反应。同时，SDT还能改善抗肿瘤药物进入肿瘤细胞的效率。因此，SDT治疗目前备受关注，未来可与靶向治疗或免疫治疗相结合形成双靶向治疗方案。

在SDT中，聲敏剂被相对低强度的UFUS激活，发挥细胞杀伤作用。空化作用是SDT的主要机制[3]，是指存在于液体中的微气核空化泡在声波的作用下振动，当声压达到一定值时发生的生长和崩溃的动力学过程。空化作用杀伤肿瘤细胞主要依靠微泡震荡坍塌产生的活性氧、高热作用和机械剪切力[4]。空化作用产生的高水平活性氧可使细胞不同水平氧化应激，继而引起细胞凋亡等进程。空化作用发生时，处于膨胀阶段的微泡剧烈振荡。当达到共振大小时，微泡快速扩大并最终爆破崩溃，微环境中会产生高压高温的冲击波。由于空化作用中微泡的振荡运动，在微泡附近流体的快速运动可产生高剪切力，从而对细胞膜造成瞬时损伤。

声孔作用/声基因转染（sonoporation/sonotransfection）是一种肿瘤基因治疗物理方法，被认为是SDT改善药物细胞转移效率的关键机制。超声波能刺激细胞半透膜的弥散过程，有利于目标物质进入细胞内部。超声转染因良好的效果可以替代基因转染的其他非病毒方法（例如电穿孔转染、脂质体转染）。通过基因转移，基因在没有细胞损伤的情况下被传递。超声诱导的细胞膜通透性变化与空化作用密切相关。空化作用使细胞膜上形成可逆凹坑，从而使基因、药物和大分子进入细胞，并可因此引起细胞对转染分子的转胞吞作用。如Rizzitelli S等[5，6]在MRI下通过SDT引爆脂质微泡，将阿霉素送入肿瘤组织中。Karki A等[7]通过UFUS成功将siRNA转染入传统转染难度大的原代T细胞。Feril LB Jr等[8]对HeLa、PC-3、U937，Meth A、T-24这5种细胞系使用UFUS进行基因转染发现，不论细胞系转染效率高低，超声转染效率均优于电穿孔转染和脂质体转染。肿瘤组织中的间质液压力（interstitial fluid pressure，IFP）明显高于正常组织，从而阻碍了药物进入肿瘤组织。Zhang Q等[9]发现，通过SDT治疗可降低肿瘤组织的IFP，使药物更好进入肿瘤组织。

SDT可以通过靶向肿瘤微环境和肿瘤细胞，作用于浸润的免疫细胞和肿瘤细胞来增强免疫原性；通过多种机制增强抗肿瘤活性，促进肿瘤中M2巨噬细胞向M1巨噬细胞的转变[10]。M1巨噬细胞通过分泌促炎细胞因子负责炎症过程，并在抗腫瘤活性中发挥作用。M2巨噬细胞抑制炎症反应，促进免疫抑制并参与肿瘤进展。恶性神经胶质瘤被M2小胶质细胞/巨噬细胞浸润，SDT能使M2巨噬细胞转化为M1巨噬细胞，延缓肿瘤进展。也有报道称[11]，SDT处理的小鼠体内树突状细胞成熟标志物CD68和CD80的表达水平显著升高，表明SDT可能促进树突状细胞成熟并增强抗肿瘤免疫力。

通过微泡和UFUS的协同作用，已有研究表明[4]，SDT对前列腺癌、胶质瘤、胰管腺癌等疾病疗效显著，这表明SDT可以成为一些目前尚无足够治疗方法的肿瘤的新备选方案。然而，UFUS的生物效应机制非常复杂，局限性在于尚未明晰只将必要有益的效应应用到目标治疗区域的方法。因此，有必要对UFUS治疗肿瘤的疗法进行进一步的研究，开发新的UFUS控制技术。这些新疗法有可能在改善当前治疗策略的同时保证癌症患者的生活质量，未来有望与靶向治疗、免疫治疗等其他疗法联合使用，成为治疗目前无法治愈的肿瘤的支柱疗法。

2人体免疫屏障

UFUS最特别的生物学效应是开放人体免疫屏障，如血脑屏障（blood brain barrier，BBB）、血睾屏障（blood-testis barrier，BTB）等。BBB和BTB虽然能防止自体免疫反应的发生、维持组织内环境稳定，但在疾病发生时同样能成为药物进入组织的阻碍。在任何特定频率下，热能或热量，以及任何生理或病理效应都取决于所传递的超声波的强度、持续时间和脉冲宽度，以及超声波通过的组织的特定特性。在极端水平下，超声波导致的过度热效应和空化作用会损坏细胞和组织。稳定的空化作用产生的机械力是安全有效地打开BBB的关键因素[12]。空化作用可导致血管壁的机械拉伸，并因此使免疫屏障开放。与聚焦超声不同，借助微泡造影剂的UFUS可以打开整个大脑的BBB，使大脑成像和广泛脑部药物输送作用更强大。

目前利用UFUS打开免疫屏障的技术主要为超声介导载药微泡靶向药物释放（ultrasound-targeted drug-loaded microbubbles destruction，UTMD）。UTMD利用了微泡保护药物有效载荷不被酶破坏的特性，能实现靶向局部给药和缓释的作用，帮助药物进入免疫屏障。Howles GP等[13]使用小鼠作为模型，在UTMD的帮助下成功打开了BBB。另外，Beccaria K等[14]使用新西兰白兔和比格犬作为模型，在动物颅骨钻孔、植入超声换能器，同样使用UTMD的方法，短暂而多次地打开了BBB。虽然UFUS照射的组织产生了中度水肿，但组织并没有出血或缺血的症状。而Kyle A[15]则使用灵长类动物非洲绿猴作为模型、无辅助剂的非聚焦超声技术完成了此项研究，并提出了此项技术潜在的风险——出血增加。用于打开血脑屏障的超声处理可能会导致红细胞外渗，进一步导致组织瘀斑出血、大面积出血、坏死和凋亡。该研究认为，出血是由BBB破坏和神经毒性剂组织纤溶酶原激活剂（tissue Plasminogen Activator，tPA）传递至脑实质引起的。Li Y等[16，17]使用UFUS打开小鼠的BTB，并将其效果与阴囊热应激效果作对比。在43 ℃热应激条件下观测到输送至输精小管的大分子数量增加。虽然在UFUS组尚未观测到上述结果，但UFUS是更温和、更快速的血睾屏障开放方法。在这些研究基础上，Beccaria K等[18]、Yao L等[19]不仅利用UFUS打开小鼠血脑屏障，并且对进入血脑屏障的药物浓度进行进一步监测。结果显示，负载荧光探针的纳米颗粒在血脑屏障被打开后在脑部的富集上升非常显著。

传统通过渗透压或缓激肽、细胞因子介导全局BBB开放的方法需要侵入性颈动脉内注射，并且BBB紧密连接被破坏，只有小于20 nm的药物能通过打开的BBB。UTMD可通过类似声基因转染的转胞吞作用促进较大的纳米颗粒穿过BBB。综上所述，UTMD技术的特点在于经颅执行、用时短、组件易于准备、打开范围广、组织学损伤小、可逆（4 h内可恢复）、不需要危险的颈动脉内注射。UFUS可以有效地打开BBB，改善纳米粒子的脑递送效率。可以预见，UTMD将成为有前途的纳米级脑疾病治疗应用技术。

3经颅超声刺激

经颅超声刺激（transcranial ultrasound stimulation，TUS）是近年开始流行的一种非侵入性神经调节形式。有研究显示[20，21]，针对动物特定大脑区域的低水平超声会改变动物行为、电生理学和突触可塑性。例如针对小鼠运动皮层，超声刺激会引起小鼠爪运动，而皮层结构或功能没有检测到变化[20]。经颅UFUS反复暴露可以影响视觉皮层诱导人体产生光幻视[22]。基于此可以认为，超声波能调节神经元活动，可能包括高级认知和意识相关的大脑活动。

近年来，聚焦于TUS的人体研究数迅速增加。例如，慢性疼痛患者接受TUS后10 min和40 min的主观情绪相较于接受安慰剂的对照组有所改善[23]。TUS对于人体的安全性已经得到证实，研究者招募健康受试者以及罹患神经和精神疾病（包括抑郁症、癫痫、痴呆、慢性疼痛）的患者进行TUS研究，仅有3%的个体报告了轻度或中度症状，包括头痛、情绪恶化、头皮发热、认知问题、颈部疼痛、肌肉抽搐、焦虑、嗜睡和瘙痒，没有受试者报告严重副作用[24]。

TUS的神經调节作用可能是兴奋性或抑制性的，具体取决于UFUS的参数。对于外周神经元，具有较短脉冲时间的超声波倾向于激活动作电位速度和幅度，而较长的脉冲则倾向于抑制[25]。在较低水平下，例如在参数为5.7 MHz和280 mW/cm2的超声暴露下，超声波可以通过机械振动刺激或抑制可兴奋组织，而不会检测到机械损伤或加热效应[23]。类似的研究有Fomenko A等[26]以低强度500 kHz的频率UFUS进行TUS，抑制了健康受试者大脑运动皮层的运动诱发电位，而Gibson BC等[27]以1～5 MHz的频率TUS使时健康受试者运动皮层兴奋性增加了33.7%（P=0.009），11 min后兴奋性与基线不再有显著差异。这表明TUS系统可用作改变初级运动皮层活动的神经调节工具。

UFUS调节神经元活动的机制尚不清楚。目前主流的观点涉及神经元膜和周围流体环境的粘弹性特性[28]，通过对电压门控通道和拉伸敏感受体的影响改变膜动作电位[29]以及TUS直接作用于细胞骨架的主要成分，即固态神经元内微管[23]。微管与突触可塑性密切相关，且神经可塑性是许多神经行为过程的基础，包括学习和记忆[27]。因此，TUS可能可以成为安全的调节治疗多种精神和神经系统疾病的非侵入性工具。未来需要更多的研究探究TUS的神经生理机制，改进靶向限制以及优化TUS协议。

4创伤治疗

UFUS的另一大治疗应用是利用热学作用治疗创伤。超声的热学作用既能杀死目标细胞，也能改善病灶部位的血液循环，加快细胞的新陈代谢，改善局部组织营养，增强酶活力，从而加快病灶的愈合。肝创伤止血治疗研究中有HIFU、射频或微波热凝固止血等方法。然而，尽管这些方法效果确切，但也存在一些缺点，比如电离辐射、热损伤正常组织、仪器设备体积大等。受HIFU焦点的影响，HIFU治疗时采用点状连续治疗，耗时相对较长，对正常肝组织也会因热效应和空化效应造成损伤甚至坏死。而UFUS作用温和，治疗副作用更小，治疗速度更快。Zhao DW等[30]报道，在较低功率时，微泡增强的UFUS即可实现肝脏创伤的快速和有效止血，并且治疗后血流灌注恢复快；微泡增强的UFUS不会对机体自身的凝血系统造成明显影响，但凝血系统的存在起到了增强止血效果的作用；微泡增强的UFUS对肝小叶微血管以及肝细胞的内部结构会造成了一定的损伤，并可导致治疗区及周围肝细胞的凋亡，但并未对血清肝酶造成长期的影响，在病理损伤上也较HIFU治疗轻。Luo Y等[31]使用UFUS照射SD大鼠胃溃疡，结果表明经超声辐照组的大鼠溃疡消失率更高，平均溃疡指数更小。病理切片显示经超声辐照后的大鼠溃疡愈合更好，经超声辐照后防御因子血清NO含量更快达到峰值，说明低强度非聚焦脉冲超声波能够促进鼠胃溃疡的愈合，其效果甚至优于雷尼替丁。

UFUS止血的作用主要来源于空化效应和机械效应损伤和阻断微血管，还可能与凝血系统有关。空化效应可以使治疗区域的血流灌注明显受阻，但是也造成细胞发生超微结构损伤，这种损伤可能启动凝血机制，而进一步阻断血流灌注而增强止血效应[32]。Zhao DW等[30]的研究中，微泡加强UFUS组的APTT和R值较其余各组明显延长，说明机体自身的凝血系统被成功激活。单纯UFUS组、单纯微泡组和对照组之间的APTT和R值无明显差异，说明机体全身的凝血功能没有因超声微泡的引入和空化效应对血管的损伤而出现明显的变化。单纯微泡组和对照组在治疗后仍可见创伤灶有明显活动性出血，说明单纯的微泡注射治疗和机体自身凝血系统的单纯作用都不能达到有效的创伤止血目的。

UFUS可与HIFU等技术联用以寻求更好的治疗效果，因为UFUS可以通过微泡造影剂辅助作为检测创伤出血口的工具从而指导HIFU技术治疗，减少HIFU暴露时间。综上所述，UFUS是治疗创伤的一大有力备选工具，具有简单、快速、安全、作用温和的特点，期待未来有更多的研究关注UFUS的治疗创伤作用，阐明UFUS的治疗机制。

5非聚焦超声在其他方面治疗的应用

除去上述非聚焦超声的主要研究的4个方向，非聚焦超声在许多其他方面有应用，尽管部分研究仍处于起步阶段。UFUS传统就用于美容，Levi A等[33]、Verner I等[34]报道显示，UFUS可以安全地治疗顽固的皮下脂肪沉积、脂肪瘤。UFUS通过对脂肪细胞膜的反复拉伸-放松作用，改变膜的通透性从而使脂肪释放。治疗30日后，受试者除游离脂肪酸水平外，未检测到血液和尿液分析物中生化标志物的明显变化以及炎症和组织修复的迹象，这表明从治疗部位释放的脂肪是通过身体自然代谢清除的。UFUS可以安全地通过人体自然代谢达到美容的效果。

Suares Castellanos I等[35]报道显示，UFUS能刺激大鼠胰岛β细胞分泌胰岛素。800 kHz的UFUS引起的β细胞释放的胰岛素与天然促分泌素葡萄糖的释放程度相当，说明UFUS的促分泌作用在细胞的生理分泌能力范围内。这个过程可能是超声波引起的钙瞬变和随后触发胰岛素囊泡胞吐作用的结果。胰岛素以钙依赖性方式从胰腺β细胞分泌，其中钙流入是葡萄糖刺激的胰岛素分泌中含胰岛素小泡胞吐作用之前的最后一个触发步骤。在较早的研究中[36]，超声波应用于牛肾上腺嗜铬细胞，导致钙的瞬时流入，引发儿茶酚胺的胞吐作用。胰岛素与儿茶酚胺的胞吐作用的机制有相似之处。UFUS促进胰岛素分泌或许可以作为治疗二型糖尿病的潜在疗法。

6總结

UFUS相较于其他治疗方法具有便捷快速、作用范围大、作用温和等优势，在肿瘤治疗、免疫屏障开放、经颅超声刺激等方面都具有巨大的开发潜力。然而，治疗性超声在临床上的应用进展仍处于初步阶段。如何在保证UFUS作用范围广的同时提高治疗效果，避免出血、非特异性损伤等副作用将是下一步研究者们待解决的难题。同时，期待将来有更多灵长类动物模型、临床前的UFUS研究，以保证其治疗效果对于人类安全且可靠。

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收稿日期：2023-02-17；修回日期：2023-03-26

編辑/肖婷婷