骨髓间充质干细胞来源的外泌体在骨再生中的新作用

尹梦星 周德智 李秀芳 贾福

摘要：外泌体作为一种膜状脂质囊泡，能够与释放到细胞外环境中的细胞内多细胞体融合。骨髓间充质干细胞来源的外泌体可以通过调节成骨细胞增殖和分化在骨重塑中发挥作用，现已成为一种治疗骨代谢疾病的有效方法。本文总结了骨髓间充质干细胞来源的外泌体对成骨再生中的调控作用以及经过药物和生物学等方法处理后的骨髓间充质干细胞来源的外泌体对骨再生的研究进展，以期为骨代谢疾病的临床治疗提供理论依据。

关键词：骨髓间充质干细胞；外泌体；成骨分化；骨再生；骨质疏松症

中图分类号：R681.1                               文献标识码：A                                   DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.04.034

文章编号：1006-1959（2024）04-0173-05

Novel Role of Exosomes Derived from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Bone Regeneration

YIN Meng-xing1，ZHOU De-zhi1，LI Xiu-fang2，JIA Fu3

（1.The Second Clinical Medical College，Yunnan University of Chinese Medicine，Kunming 650500，Yunnan，China;

2.College of Health Science and Technology，West Yunnan University of Applied Sciences，Dali 671000，Yunan，China;

3.Department of Orthopaedics，Yan'an Hospital Affiliated to Kunming Medical University，Kunming 650051，Yunan，China）

Abstract：Exosomes， as membranous lipid vesicles， are capable of fusing with intracellular multicellular bodies released into the extracellular environment. Exosomes derive from bone marrow mesenchymal stem cells play a role in bone remodeling by regulating the proliferation and differentiation of osteoblasts and have become an effective method for the treatment of bone metabolic diseases. In this review， we summary the regulatory effect of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes on bone regeneration and the research progress of bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes on bone regeneration after treatment with drugs and biological methods， providing theoretical basis for the clinical treatment of bone metabolic diseases.

Key words：Bone marrow mesenchymal stem cells;Exosomes;Osteogenic differentiation;Osteanagenesis;Osteoporosis

研究發现骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyml stem cells，BMSCs）的异常增殖和分化可导致骨质疏松、骨关节炎、脊柱结核、骨肿瘤等多种骨病[1]。其中骨质疏松是老年人常见的全身代谢性骨病，表现为骨量减少、骨脆性增加。现有的治疗方法只能减缓骨质疏松的进程，降低骨折的发生风险，只是对骨折进行局部修复，存在疗效差、不良事件频发、骨生长和矿物质沉积异常和患者依从性较差等问题。外泌体（exosomes，Exos）是与释放到细胞外环境中的细胞内多细胞体融合的膜状脂质囊泡，直径为30～120 nm，可将供体细胞内的蛋白、RNA、核酸等远距离膜性转运到受体细胞发挥调控作用，包含蛋白质、脂质、miRNA、mRNA、细胞因子等多种生物活性物质。在骨组织中，几乎所有类型的细胞都会分泌外泌体。Exos具有与源细胞相似的生物活性，在细胞间通讯中发挥重要作用，携带的多种内含物可以直接作用于骨骼细胞，参与骨骼细胞的增殖和分化[2]。因此，研究骨髓间充质干细胞来源的外泌体（bone marrow mesenchymal stem cells - exosomes，BMSCs-Exos）参与调控骨骼细胞的增殖和分化，可为骨病的研究提供理论依据，对骨病的诊断和治疗具有一定的临床意义。本文综述了BMSCs-Exos通过调节多种蛋白质、作用miRNA、调控通路、参与多种生物学过程和骨组织工程以及经过药物和物理等处理后对骨再生作用的影响，旨在为BMSCs-Exos参与骨代谢疾病的临床治疗提供证据支持。

1 BMSCs-Exos

间充质干细胞由于自身可以不断更新、分化被广泛应用于多种疾病，BMSCs属于这种多能细胞。它来源于中胚层，具有旁分泌功能，因此在骨再生中具有重要作用[3]。BMSCs作为目前骨代谢相关疾病临床试验中广泛应用的细胞类型，通过旁分泌功能释放大量细胞外囊泡发挥作用，Exos是BMSCs生产的最主要的细胞外囊泡类型。BMSCs-Exo具有与其母细胞单元相同的内容和属性，其组成不同于其他来源的外泌体。

在骨重建过程中，一方面，BMSCs-Exos能释放参与骨形成的蛋白质和RNA等成分；另一方面，BMSC-Exos含有多种参与骨重建的抗炎因子和生长因子。与BMSCs相比，BMSC-Exos体积更小，没有细胞活性，不仅可以穿透血脑屏障和血脊髓屏障，还可以选择性地渗透到炎症组织部位[4]。同时可以作为纳米级靶标载体，充分利用增强的渗透效应作用在相应的靶点位置。BMSCs-Exos参与调控骨细胞增殖分化、促进血管再生及免疫调节、抑制炎症反应等过程，已成为骨再生医学和免疫学中最主要的干细胞外泌体来源。

2 BMSC-Exos对骨再生的影响

在整个骨重塑过程，成骨细胞（osteoblast，OB）的分化、增殖和成熟后的矿化是骨再生的重要评价指标。研究显示[5]，在BMSCs-Exos不同浓度下刺激OB，细胞增殖率与浓度呈正相关，表明BMSCs-Exos可有效促进OB增殖分化，且具有剂量依赖性。以下就BMSC-Exos对骨再生的影响进行介绍。

2.1调节蛋白  研究者采用BMSC-Exos处理OB后发现SATB2和环AMP依赖性转录因子4的蛋白表达显著增加，这些蛋白表达的变化促进了OB增殖分化和骨再生[6]。在一项研究中发现[7]，BMSC-Exos通过增加骨钙素和骨形态发生蛋白2的表达改善了小鼠股骨组织中的炎症并促进碱性磷酸酶活性和钙沉积水平。BMSC-Exos还可以通过内吞作用进入OB以此来调节成骨相关蛋白ALP、OCN、Runx2的表达，在颅骨缺损大鼠模型中BMSCs-Exos刺激能促进骨缺损处新骨再生和血管生成[8]。还有研究发现BMSCs-Exos中的Fas蛋白可调节miR-29b/Dnmt1/Notch表观遗传级联来改善BMSCs功能[9]，表明BMSCs-Exos可以靶向作用于OB发展传递过程中的蛋白来影响成骨分化和增殖，调节整个骨再生过程。

2.2调节多种RNA  既往研究表明[10]，在骨代谢调节过程中miRNA起着调节剂的作用，比如miR-181a、miR-221、miR-155、miR-885-5p等在骨代谢过程中表达显著下调，而miR-135b、miR-302b、miR-299-5p、miR-219等表达上调，大量证据揭示了miRNA可能是骨质疏松治疗的潜在靶点。随着研究的深入，许多研究者发现更多的miRNA在调节OB增殖分化及成骨相关转录因子表达方面同样发挥重要作用。有研究发现[11]，BMSCs-Exos传递的miR-196a通过靶向Dkk1激活Wnt/β-catenin通路在增强OB分化中起重要作用，而当miR-196a被剥夺时，BMSCs-Exo未能发挥作用；BMSCs-Exo衍生的miR-206通过减少Elf3促进骨关节炎中OB的增殖分化[7]。除此之外，来自BMSCs-Exos的miR-935一方面可以通过靶向下调转录激活因子3信号转导，同时也可以进一步降低转录激活因子1的表达，从而促进整个骨再生过程，最终改善骨代谢紊乱[5]；而在BMSCs-Exos中miR-1297的作用刚好相反，通过靶向阻断Wnt信号通路，从而降低成骨相关转录因子Runx2、Osterix的表达，通过抑制OB分化减弱骨再生作用[12]。lncRNA在调节细胞增殖、分化、成熟和凋亡等多种细胞生理活动中具有重要作用。有研究将来源于BMSCs-Exos的lncRNA与人成骨细胞共培养，发现肺腺癌转移相关转录物1可增强人成骨细胞的活性[6]。加载tsRNA-10277的BMSCs-Exos会影响类固醇诱导的股骨头坏死患者中BMSCs的脂肪生成和成骨作用，数据显示tsRNA在Wnt/β-catenin信号通路中明显富集[13]，展现出显著降低成脂和增强成骨分化的作用。

以上研究表明BMSCs-Exos介导多种RNA干预成骨分化，其中以miRNA研究最为广泛，可通过靶向调节相关成骨通路和抑制转录因子表达实现骨再生作用，在BMSCs-Exos中的lncRNA、tsRNA等仍需大量研究支持。

2.3调控通路  Wnt/β-catenin信号途径是抑制BMSCs成脂基因表达、恢复OB增殖分化的重要信号机制，研究表明BMSCs-Exos通过恢复受体BM-MSC的功能和激活Wnt/β-catenin信号传导来减轻由辐射引起的骨丢失[14]。除此之外，有研究将BMSCs-Exos与OB共培养后发现[15]，MAPK信号通路相关蛋白表达增加，且细胞周期S期比例显著升高，表明BMSCs-Exos可通过激活MAPK信号通路促进OB增殖分化，展现出改善骨丢失的巨大潜力；还有研究者发现BMSCs-Exos可以通过介导Hippo信号通路转移miR-186以促进成骨分化能力[16]；不仅如此，在股骨骨不连的大鼠模型中移植BMSC-Exos后明显增强了成骨作用、血管生成和骨愈合过程，证实BMP-2/Smad1/Runx2信号通路在BMSC-Exos诱导的促成骨分化和促进骨不连的骨折愈合中发挥关键作用[17]。目前，BMSCs-Exos发挥骨再生作用主要涉及的通路与调节成骨分化息息相关。

2.4参与生物学过程  在骨形成过程中，血管生成和骨再生是相互依存的，血管生成是新骨形成之前的重要步骤。研究表明BMSCs-Exos可以被人脐静脉内皮细胞吸收，促进该细胞增殖、迁移和血管形成，在骨形态学检测中，BMSCs-Exos处理后展现出更致密的骨微结构，增加了骨小梁的数量和厚度[18]，表明BMSCs-Exos通过调节血管生成促进骨形成。炎症的发展形成对骨再生起抑制作用，BMSCs-Exos可以在组织愈合过程中调节多种炎症因子，减缓炎症进程以此增强腱骨愈合[19]，还可以通过调控M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞极化，使得微环境中的炎性因子水平下降[20]，而这个过程有利于炎症中的软骨进行修复。还有研究发现BMSCs-Exos通过作用于粒体，抑制p38和ERK的磷酸化，促进Akt的磷酸化[21]，最终通过抑制线粒体诱导的软骨细胞凋亡来介导骨再生过程。这表明BMSCs-Exos可促进血管生成、减轻炎症反应和参与磷酸化过程實现骨再生。

2.5骨組织工程  缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）在骨缺损修复中作用显著，具有促进成骨和血管再生的双重功能。实验发现携带突变体HIF-1α的大鼠BMSCs-Exos与β-磷酸三钙人工骨相结合可通过促进新骨再生和新血管形成修复骨缺损[22]。分层多孔结构作为基因传递的纳米载体和组织再生的框架已被广泛研究，其中微/纳米纹理分层钛拓扑结构比其他拓扑结构更具生物活性和仿生性，应用更广。研究发现优化的微/纳米纹理分层钛可通过刺激BMSCs-Exos分泌来促进钛植入物的骨整合[23]。在另一项研究中发现[24]，将锶取代的硅酸钙结合BMSCs-Exos后，可显著促进人脐静脉内皮细胞的体外血管生成，有助于加速斑马鱼的发育和新生血管形成以及加速大鼠股骨远端缺损部位的骨再生，研究者提出该结合可作为候选成骨组织工程的外泌体。可见，BMSCs-Exos在骨组织工程中主要以调节血管生成实现血管化骨再生作用。

3经处理后的BMSCs-Exos对骨再生的影响

3.1药物处理  在研究青蒿琥酯（artesunate，ART）处理BMSC-Exos后对骨平衡的影响中，发现小核仁RNA宿主基因7（small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7）在BMSC-Exos中上调两倍[25]，表明ART处理后的BMSCs-Exos通过调节TAF15/RUNX2轴递送SNHG7促进成骨分化。申恩谱等[26]发现褪黑素预处理后的BMSC-Exos通过激活Wnt1/β-catenin信号通路显著促进BMSCs成骨分化，提高了碱性磷酸酶活性，展现出更致密的矿化结节；杨彬等[27]发现利拉鲁肽作用下BMSC-Exos中的miR-31a-5p/E2F2可逆转破骨细胞数量减少和β细胞凋亡的情况，显著改善2型糖尿病大鼠β细胞的损伤和骨代谢。表明BMSC-Exos可作为药物载体，精准运输至相应靶点发挥药效作用，从而协助实现骨再生作用。

3.2物理处理  已有研究报道机械负荷在调节骨重塑和代谢平衡中起着至关重要的作用[28]。研究显示[29]，采用循环机械拉伸处理的BMSCs-Exos干预后可以在体外减弱NF-κB信号通路活性来强烈抑制破骨细胞分化从而影响骨平衡，可以在小鼠模型中挽救由机械卸载引起的骨质疏松症。经过缺氧预处理的BMSCs-Exos的促血管生成能力的潜力高于来自在常氧条件下培养的BMSCs-Exos，而低氧预处理的BMSCs-Exos可显著防止骨丢失并增加股骨头的血管体积[30]。还有研究表明[31]，低强度脉冲超声介导的BMSCs-Exos可以促进软骨再生，增加软骨细胞增殖和细胞外基质合成，抑制炎症，并抑制白细胞介素-1β诱导的NF-κB通路的激活进而促进骨形成。表明BMSCs-Exos在部分物理手段处理后，展现出更为优秀的骨再生能力。

3.3其他处理  正常生物学加工过程中的BMSCs-Exos可在由肥胖引起的异常成骨分化和骨折愈合不良方面发挥作用，通过高脂处理可以抑制BMSC-Exos的分泌和异骨分化，减缓骨丢失进程[32]。TNF-α是骨代谢发生发展过程中的关键调节剂，通过上调MC3T3-E1细胞中的caspase-3和Bax蛋白表达来抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。研究发现经过circRNA-Rtn4修饰后的BMSC-Exos能减弱TNF-α诱导的MC3T3-E1的细胞毒性和细胞凋亡[33]，表明Rtn4-Exos有望成为治疗TNF-α诱导骨质疏松症的一个选择。

4总结与展望

BMSCs-Exos通过内吞作用进入靶细胞内部从而发挥生物活性，表现出的能力还与BMSCs具有很大的同源性。同时，提取的BMSCs-Exos可在-20 ℃下保存6个月，仍然能保持其生物活性。BMSCs-Exos具有很强的增殖能力和很强的生存能力，使其成为多年来的骨代谢疾病防治中的一个热门研究领域。BMSC-Exos可以通过自身含有的蛋白、RNA、核酸、骨再生相关因子及其他活性物质调节成骨细胞、破骨细胞、骨细胞、软骨细胞等的生物学行为，还可以通过Wnt、MAPK、Hippo等信号通路介导骨微环境中的通讯。更重要的是BMSC-Exos可以作为骨组织工程干细胞外泌体的重要来源，在骨组织工程和骨再生领域具有良好的应用前景。Exos作为一种天然的内源性纳米载体，可通过受体介导的内吞作用参与骨重建过程中各细胞间的信息交流，BMSC-Exos作为药物载体具有潜在的应用前景，也值得进一步深入研究。

不过目前对BMSC-Exos的研究还不够深入，虽然BMSC-Exos在骨再生过程中发挥着重要作用，许多基础研究报道BMSC-Exos对动物模型中的骨再生有积极影响，但内部诸多物质仍不能具体明确，作用途径和发挥的效能机制仍需要投入更多的研究。因此，现在若将BMSCs-Exos应用于临床要把握好尺度，相信随着未来对BMSCs-Exos的深入，有望通过BMSCs-Exos为骨代谢相关疾病的基础研究和临床诊治开辟新见解。

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收稿日期：2023-02-21；修回日期：2023-03-14

编辑/王萌