血栓通对阿尔茨海默症模型小鼠认知功能及神经异常兴奋性的作用及其机制研究

刘 慧 ，严国纪 ，吴 嘉 ，王 丹 ，习杨彦彬 ，李珊珊

（1）昆明医科大学神经科学研究院;2）基础医学院实验教学中心，云南 昆明 650500）

阿尔茨海默病（alzheimer’ s disease，AD）是最典型的痴呆症形式，预计老年人的发病率将进一步呈指数级增长，导致全球近4 700 万人患病[1]。AD 的特征是认知能力的逐渐下降，这将会对患者的家庭和卫生保健系统造成沉重的负担。研究人员一直在试图寻找可能有助于减缓AD 进展的药物治疗方法。然而到目前为止的结果并不令人满意[1]。因此，开发治疗AD 的新药成为当务之急。

血栓通是一种临床上常用于预防和治疗缺血性疾病的中药制剂，其有效成分主要为三七皂苷[2]。研究表明，血栓通能够在抗心肌梗死、抗血栓形成、抗脑缺血/再灌注损伤、抗氧化和改善微循环障碍等方面发挥作用[3-7]。作为血栓通的主要成分，三七皂苷在多种疾病中的治疗作用也被广泛报道[8-12]。研究表明，血栓通在AD 动物模型中具有神经保护作用[13]。血栓通在AD 早期通过提高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等抗氧化酶的活性来对抗氧化应激损伤[14]，也可通过调控α 和β 2 种分泌酶来减少Aβ1-42和Aβ1-40沉积从而减少淀粉前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）产生[15]。然而在AD 小鼠模型中血栓通是否通过调节神经元兴奋性发挥神经元保护作用尚不清楚。

在本课题组之前的研究中证实，Navβ2 的编码基因SCN2B 可能与快速老化小鼠额叶和海马的老化进程密切相关[16]；SCN2B 下调60.68%通过增加海马神经元棘突的数量，显著改善转基因小鼠海马依赖性的空间认知记忆并且有利于易化海马神经元的长时程电势[16]；在AD 动物海马中Navβ2 增龄性表达上调的同时还存在显著的功能异常，表现为Navβ2 过度降解（由BACE1 及γ-secretase）及促使钠离子通道蛋白功能亚基Nav1.1α发生异常的细胞内转位，Navβ2 knockdown 部分纠正了APP/PS1 转基因鼠海马和额叶皮质中Navβ2 的异常状态，扭转了Navβ2 的过度降解及异常的Nav1.1α 细胞内转位，部分恢复了APP/PS1转基因鼠海马神经元的电兴奋性，并显著改善转基因小鼠学习记忆能力，促使APP 向非淀粉样酶解途径进展[17-18]。这些研究结果确定了SCN2B 在脑老化认知功能障碍发生中的作用；而血栓通用药后可以显著逆转SCN2B 在快速老化小鼠大脑组织中的增龄性表达上调[16]。综上所述，结合文献报道及前期研究工作，笔者推测血栓通的抗脑老化作用可能与对学习记忆功能脑区Navβ2 的表达调控相关，本文围绕此论点展开研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物2 月龄的C57BL/6J 小鼠（野生型，WT 小鼠）购自昆明医科大学实验动物中心，APP/PS1 转基因小鼠购自美国杰克逊实验室。小鼠均分笼饲养与21 ℃～25 ℃的转基因动物房内，相对湿度50%～60%，光照时间为12 h/ 12 h 昼夜交替，饲料与饮水正常供给。本研究通过昆明医科大学伦理委员会批准进行实验动物护理和相关操作，伦理批号：Kmmu20190024。手术过程中采用异氟烷诱导麻醉。

1.1.2 药品来源血栓通为云南植物药业有限公司生产的注射液，主要成分为PNS，总苷含量 >70%（Rb1 >30%，Rg1 >20%，R1 >5%），批号：Z53020135，规格：100 mg/2 mL 每支。

1.2 动物分组

APP/PS1 转基因小鼠被随机分成两组，每组15 只，药物治疗组用灭菌医用0.9% 氯化钠按5 mg/mL 配制，以60 mg/kg 对血栓通组（APP/PS1+PNS）行灌胃，每日1 次，连续6 个月给药。对照组小鼠予同等体积的0.9% 氯化钠（APP/PS1+Vehicle）灌胃处理，同月龄野生型小鼠予0.9%氯化钠灌胃处理作为正常对照组（WT+Vehicle）。

1.3 新物体识别实验

连续给药6 个月后，进行新物体识别实验（硬件及分析软件均购自上海欣软信息科技有限公司），评估小鼠对新物体任务的记忆。使用一个40 cm×40 cm×40 cm 的透明塑料盒作为实验仪器，全程摄像头记录。实验持续3 d。实验第1 天为小鼠适应阶段，将小鼠放入仪器进行实验前的环境适应，时间为5 min，在此时间内小鼠可以自由的探索实验环境，此时环境不放置任何物体。第2 天，在仪器内放置两个完全相同的物体，将小鼠从同一位置放入仪器，进行5 min 的探索。第3 天，一个新物体作为仪器中一个物体的替代品，再将小鼠从相同位置放入仪器，进行5 min的探索，并记录小鼠探索新物体和原有旧物体所花费的时间。计算每只小鼠的物体辨别指数（discrimination index，DI）。DI=（探索新奇物体的时间-探索熟悉物体的时间）/（探索新奇物体的时间+探索熟悉物体的时间）×100%。

1.4 Morris 水迷宫实验

Morris 水迷宫由1 个圆形池（直径100 cm，深50 cm）组成，里面充满了（24±1）℃以及20 cm深的白水。Morris 水迷宫按文献描述进行[16]。所有的小鼠都进行1 个初步的预实验，让它们能够适应水，并让它们踩上1 个白色的平台（隐藏在水面下），这样可排除小鼠因游泳能力不足或视力障碍而不能找到平台干扰实验结果。预实验是在常规测试的前1 天进行。在这个实验中，小鼠被放置在水中游60 s，然后被放置在1 个淹没在水下的白色平台上停留1～2 s。预实验结束后是为期5 d 的学习训练，隐藏的平台被放置在1 个不同的位置。小鼠从入水至发现隐藏的水下白色平台所需的时间被记录为逃逸潜伏期，并连续记录5 d。在训练第6 天的探针实验中，平台被移除，在60 s，记录小鼠在目标象限中花费的时间百分比、在目标象限中游泳路径和通过目标平台的次数，以及在这四个象限内所花费的时间和游泳的总距离，以评估它们对平台位置的记忆。用头顶摄像机跟踪动物，数据用动物行为视频分析系统进行分析（上海欣软信息科技有限公司）。

1.5 脑电图检测

对于脑电图（electroencephalogram，EEG）记录，研究中使用了使用聚酰亚胺微电极阵列（PBM 阵列）的高分辨率小鼠脑电图。根据文献进行电极植入、脑电图记录、数据采集和分析方法操作[17，19-20]，并进行了一些改良。麻醉电极麻醉后将小鼠固定在立体定向仪器上，然后记录脑电图。首先，切开头皮中部2 cm 暴露颅骨，确定颅骨和颅点。根据小鼠脑图谱，这些点是小鼠大脑表面可识别的电极位置。在小鼠脑立体定位仪的指引下将电极植入海马（AP-2.1 mm，ML-1.5 mm，DV-1.5 mm），其中植入1 个裸露尖端的三导线电极（直径1.0 mm），由3 根裸露尖端的聚酰亚胺涂层的导线组成，用于接地和参考的微螺钉分别固定在小脑上方的枕骨上。植入微电极的小鼠予术后5～7 d 的时间恢复。记录当天，信号采集在小鼠的笼子中进行，从上午10 时至11 时采集自由移动小鼠的脑电图信号。将连接器连接到一个多通道的脑电图放大器系统，并收集神经电信号。由记录电极收集到的原始记录信号被放大器放大1 000倍。模拟信号由CEDMicro1401 数据采集系统以1 kHz 的采样频率进行数字化，记录每30 s 生成一次功率谱密度（power spectral densities，PSDs），以计算在>6 Hz（高频）的持续时长（高频时间）。信号处理确保整数值代表每30 s 内Hz 的主导频率（dominant frequency，DF）。以30 s 为1 个记录周期，每只小鼠每30 s 计算1 次，收集计算每只小鼠在总记录时间（1 h）的平均DF。高频时间的计算方法是用DF >6 Hz 将30 s 总周期相加，然后除以每个小鼠记录的总时间[17，20]。

1.6 Western blot

脑电图记录（1 周后），小鼠颈椎脱位。取出大脑，浸泡在冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。一半的大脑用于免疫印迹，其余的用于细胞表面生物素化检测。对于Western blot 分析，脑组织分别使用预冷的裂解缓冲液（碧云天生物技术公司）在冰上匀浆。匀浆液在4 ℃下以r/min。使用BCA试剂（Sigma-Aldrich;Merck KGaA，Darmstadt，Germany）方法定量蛋白质。在4%～12%的凝胶上，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白质并转移到硝化纤维素膜上，将硝化纤维素膜转移到封闭液中，室温封闭1 h，封闭后将膜放入1×TBST 中清洗10 min。随后，与抗BACE1（1:1 000;Cat.No.ab2077;Abcam），Nav1.1α（1:800;Cat.No.ASC-001;Alomone），或Navβ2（1:500;Cat.No.ASC-007;Alomone）一抗进行孵育。GAPDH（1:800;Cat.No.Sc-365 062;Santa Cruz，Delaware，CA，USA）作为内参对照。随后将膜与适当的二抗在20～25 ℃下孵育2 h。用辣根过氧化物酶偶联的抗兔抗体检测Nav1.1α 和Navβ2（1:2000;Cat.No.PI-1 000;Vector Laboratories，Inc ），GAPDH 检测采用过氧化物酶偶联的抗小鼠二抗（1∶1 000;Cat.No.PI-2000;Vector Laboratories，Inc）。采用增强化学发光发光试剂（碧生物技术研究所，上海，中国）进行蛋白质定量。使用Bio-Rad 凝胶成像系统（ChemiDoc™ XRS+;Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA，USA）及分析软件v4.6.6（Bio-Rad 实验室公司）对目标蛋白带进行密度分析，以量化蛋白表达水平。

1.7 细胞表面生物素化实验

将剩余的脑组织放入冰冷的Krebs 溶液中，该溶液中含有先前描述的[20]修饰成分（计量单位为mmol/L）：120 氯化钠、4.5 氯化钾、1.5 磷酸氢二钾、10 葡萄糖、1.5 硫酸镁、26 碳酸氢钠和1.5 氯化钙。细胞表面生物素化和细胞表面Nav1.1α 的检测步骤按文献报道进行[17，20]。使用中微子亲和素琼脂糖珠（美国皮尔斯）拉下生物素化蛋白质，将生物素化的细胞表面蛋白与琼脂糖珠结合，用于进行细胞外表达分析。其余含有非生物素化蛋白的裂解液用于检测Nav1.1α 的细胞内蛋白。用SDS-PAGE 样品缓冲液在37 ℃下孵育60 min 进行洗脱，并通过SDS-PAGE 分析，然后进行如上所述的Western blot 检测。

1.8 统计学处理

使用SPSS19.0 Windows 软件包进行统计分析。数据以均数±标准差（）表示。2 组间的比较采用Student’s t检验。采用方差分析（ANOVA）和Bonferroni事后检验来评估多组间的统计学差异。Morris 水迷宫分析采用双向重复测量（RM）方差分析，然后采用Tukey检验。新物体识别实验数据采用双向方差分析进行分析。脑电图数据采用单因素方差分析，然后对配对组（Two tailed，双尾组）进行t检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血栓通对APP/PS1 小鼠认知功能障碍的影响

采用Morris 水迷宫实验和新物体识别实验，评价血栓通对APP/PS1 小鼠学习记忆功能的影响。双向重复测量方差结果显示，WT+Vehicle、APP/PS1+Vehicle 和APP/PS1+PNS 组中小鼠的逃逸潜伏期随着时间的推移而逐渐缩短。2 月龄小鼠逃逸潜伏期各组之间差异无统计学意义（P>0.05）。然而，与年龄匹配的WT 小鼠相比，8 月龄APP/PS1 小鼠花了更多的时间来寻找隐藏的平台，差异有统计学意义（P<0.05），见图1A。在去除平台后的探针实验中，各组2 月龄小鼠在目标平台穿梭次数、目标象限花费的时间和目标象限的路径百分比方面差异无统计学意义（P>0.05），见图1B，图1C，图1D。与同月龄WT 小鼠相比，8 月龄APP/PS1 小鼠在目标象限的时间缩短，目标平台穿梭的次数减少，在目标象限的路径百分比降低。血栓通处理部分改善了APP/PS1 小鼠的空间学习记忆能力（P<0.05），见图1B，图1C，图1D。

图1 Morris 水迷宫任务显示血栓通对APP/PS1 小鼠空间学习记忆变化的影响Fig.1 Morris water maze task shows the effect of xueshuantong on spatial learning and memory changes in APP/PS1 mice

从新物体识别实验中获得的DI 显示，2 月龄的WT 和APP/PS1 小鼠在探索新物体方面无显著差异（P>0.05），见图2B。与年龄匹配的WT 小鼠相比，8 月龄APP/PS1 小鼠在探索新物体上花费的时间更少（P<0.05），见图2B。血栓通治疗增加了APP/PS1 组探索新对象的时间（APP/PS1+PNSvs.APP/PS1+Vehicle，P<0.05），见图2A，2B。综上所述，血栓通是一种改善AD 转基因小鼠空间学习和记忆丧失的有益药物，见图1，图2。

图2 血栓通对APP/PS1 小鼠新物体识别任务的影响Fig.2 Effect of xueshuantong on novel object recognition task in APP/PS1 mice

2.2 血栓通对APP/PS1 小鼠神经元兴奋性的影响

为了研究血栓通对APP/PS1 小鼠异常神经元高兴奋性的影响，本研究对不同处理的WT 小鼠和APP/PS1 小鼠进行了脑电图记录。根据EEG 记录结果显示，与相同月龄的WT 小鼠比较，8 月龄APP/PS1 小鼠神经活动出现明显异常，棘波放电（spike-wave discharges，SWDs）增加，见图3。然而，用血栓通处理的8 月龄APP/PS1 小鼠表现出下降的神经元兴奋性，但没有达到年龄匹配的WT 小鼠的水平，见图3。

这些结果表明，血栓通处理改善了APP/PS1突变诱导的神经元高兴奋性。

2.3 血栓通对APP/PS1 小鼠体内BACE1 和Nav表达水平的影响

本研究探讨了血栓通改善认知功能、下调神经元兴奋性的机制。本研究评估了神经元电兴奋性的维护者Nav 蛋白家族成员和BACE1 在各组小鼠额叶皮质及海马区的表达情况。结果发现，血栓通处理显著降低了APP/PS1 小鼠皮质和海马中BACE1 的表达（APP/PS1+PNSvs.APP/PS1+Vehicle，P<0.05），见图4A-4B。同时，在血栓通处理的APP/PS1 小鼠中检测到Navβ2 全长片段增加，Navβ2-CTF 片段减少（APP/PS1+PNSvs.APP/PS1+Vehicle，P<0.05），见图4C-4D。这些结果还表明，血栓通对皮质或海马中Nav1.1α的细胞外和细胞内异常分布进行了纠正（APP/PS1+PNSvs.APP/PS1+Vehicle，P<0.05），见图4E-4H。

图4 血栓通改变APP/PS1 小鼠中Nav1.1α 的分布和Navβ2 的裂解Fig.4 Xueshuantong alters Nav1.1α distribution and Navβ2 cleavage in APP/PS1 mice

综上所述，血栓通诱导的神经元兴奋性的减轻可能与Navβ2 切割的减少有关，从而部分逆转了Nav1.1α 在皮质或海马中的异常分布。

3 讨论

本研究结果显示血栓通（主要有效成分三七皂苷）给药后显著改善了APP/PS1 小鼠学习、空间记忆功能并减轻了神经元的异常高兴奋性。结合前人的研究报道：APP/PS1 小鼠皮质裂解液中BACE1 表达水平、Navβ2 降解片段（Navβ2-CTF）以及Nav1.1α 的表达和分布发生异常[20]，作者推测：血栓通改善AD 小鼠的认知功能和神经元高兴奋性可能与对Nav 通道的表达调控有关。

临床上以颅内/脑出血为特点[21]的常见脑损伤，通常发展为认知缺陷的症状[22]。而前人的研究表明，通过结合抗炎、抗血栓和抗凋亡特性，PNS 在治疗伴有认知障碍的神经系统疾病中具有显著优势[7-8，23]。已有研究报道，使用血栓通可减少急性脑出血患者的炎症反应，增加血肿吸收，并改善行为功能[12]。在本研究中，作者发现血栓通可能有助于改善认知功能缺陷和恢复AD 诱导的神经元损伤。通过研究，作者发现，血栓通改善了APP/PS1 突变引发的学习记忆障碍并降低了神经元的过度兴奋性。

Nav 家族蛋白在神经元动作电位的发放、正常电兴奋性的维持中起到了主导作用，其家族成员的表达异常、活性改变势必会诱导神经元电兴奋性发生异常，引发一系列的病理改变。在先前的研究中，作者发现，与4 月龄（正常）快速老化小鼠相比，SCN2B（Navβ2 的编码基因）在8、12月龄加速老化的小鼠皮质额叶中表达上调，血栓通用药后显著下调了8、12 月龄快速老化小鼠脑内衰老相关基因SCN2B（Navβ2 的编码基因）的水平，诱导了学习记忆行为的改善[16]，此结果提示Navβ2 在小鼠脑老化进程中发挥了重要作用，而血栓通有可能通过对Navβ2 的靶向调控发挥神经保护作用。另有研究表明，Nav1.1α 水平的升高与小鼠的认知缺陷有关[20]；而Navβ2 knockdown可以扭转Navβ2 的过度降解及异常的Nav1.1α细胞内转位，部分恢复APP/PS1 转基因鼠海马神经元的电兴奋性并显著改善APP/PS1 小鼠的学习记忆能力[17-18]。在本研究中，发现血栓通抑制了APP/PS1 小鼠脑内BACE1 的活性，从而减少了Navβ2 的过度降解，纠正了Nav1.1α 的异常表达与分布。此结果提示，血栓通在APP/PS1 小鼠模型中发挥的神经保护作用与Nav 蛋白调控的神经元高兴奋性的恢复有关，即血栓通通过调节钠通道的表达，从而纠正了AD 小鼠的异常神经元兴奋性并改善了AD 小鼠的认知功能损伤。

有趣的是，本研究还发现了血栓通用药后显著抑制了淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）代谢关键酶BACE1 的活性。鉴于BACE1 抑制可以有效减少APP 毒性代谢产物Aβ 的产生，近年来，BACE1 酶抑制剂的使用为AD 提供了有价值的治疗策略[24-26]。而有研究证实，Navβ2 作为BACE1 的新发现底物，具有与APP 类似的代谢途径，可能参与到了AD 的致病过程[27]。本研究结果发现，血栓通处理显著抑制了BACE1 的活性、减少了Navβ2 的裂解，也纠正了Nav1.1α的异常分布，部分恢复了神经元异常的兴奋性。此结果提示血栓通可能有希望成为治疗AD 的药物之一，其作用机制可能通过抑制BACE1 介导的Navβ2 异常酶解、维持Nav 通道的稳定性，从而恢复了神经元的正常电兴奋性。

综上所述，本研究结果表明，血栓通改善了神经元异常过度兴奋，显著促进了AD 小鼠的神经元修复和改善记忆功能，此作用与Nav 蛋白的调节有关。