肠道菌群代谢物TMAO 与非酒精性脂肪性肝病的关系

李媛媛 ，宋亚贤 ，徐玉善 ，曾晓甫 ，袁 惠 ，徐 兆 ，江 艳

（1）昆明医科大学第一附属医院内分泌一科;2）超声科，云南 昆明 650032）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是目前全球最常见的肝脏疾病之一，在我国，成人NAFLD 总患病率为32%，明显高于全球患病率，且呈逐年上升趋势，是我国重要的公共卫生问题[1]。目前，NAFLD 在全球范围内表现出最显著的肝硬化增长，是全世界引起肝硬化发病的高危因素[2]。

肠-肝轴是肝脏与胃肠道在解剖上紧密联系，许多的证据表明，肠道微生物群及其代谢产物直接影响肠道形态和免疫反应，导致炎症和肠道内毒素血症的异常激活；肠道微生态失调也会导致肠道肝脏功能障碍，胆汁酸代谢途径的改变[3]。

肠道微生物群及其代谢产物可以作为肠道和肝脏之间的分子载体，一些特定的肠道微生物群和代谢产物，包括短链脂肪酸、胆汁酸、脂多糖、胆碱和三甲胺（trimethylamine，TMA），会随着疾病的严重程度和纤维化阶段而发生变化，这表明这些物质具有作为诊断NAFLD 标志物的潜力，因此，有必要对肠肝轴进行进一步的研究[4]。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2020 年11 月至2021 年11 月期间在昆明医科大学第一附属医院内分泌一科住院及门诊体检就诊者共计118 例。根据研究对象超声定量肝脏脂肪含量结果，分为2 个组。肝脏脂肪含量≥9.15%为NAFLD 组，共86 例，男49 例，女37 例，平均年龄（50.63±15.02）岁；肝脏脂肪含量<9.15%为健康对照组，共32 例，男12 例，女20 例，平均年龄（40.34±12.47）岁。

所有研究对象均签署知情同意书，并经昆明医科大学第一附属医院伦理委员会批准（2022 伦审L 第10 号 ）。

NAFLD 诊断标准根据2010 年中华医学会肝脏病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组制定的《非酒精性脂肪性肝病的诊断标准》[10]，排除有大量饮酒史、肝纤维化、恶性肿瘤，伴有病毒性、药物性、自身免疫性、全胃肠外营养、肝豆状核变性等明确损肝因素导致脂肪肝的特定疾病。

健康对照组为体检健康人群，排除有高血压、血脂异常、冠心病、脑梗、糖尿病、恶性肿瘤病史；调查前1 个月内及调查中未使用可能影响糖代谢的药物，如糖皮质激素、甲状腺素、噻嗪类药物等。

1.2 临床指标收集

详细采集研究对象相关临床资料：性别、年龄、身高、体重、腰围、臀围、吸烟史、饮酒史、既往疾病史、用药史、家族史，并准确记录受试者空腹血糖（FPG）、糖化血红蛋白（HbA1C）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GGT）、血清总胆汁酸（TBA）、尿酸（UA）、肾小球滤过率（GFR），根据公式计算出胰岛素抵抗指数（HOMA Insulin Resistance，HOMA-IR）[11]，公式如下：

1.3 饮食结构问卷调查及超声定量肝脏脂肪含量

由本课题组的医生对所有受试者进行饮食结构问卷调查，调查方式采用一对一、面对面问卷调查。所有受试者使用Hitachi 超声诊断仪4C 突阵探头在受试者仰卧位，充分暴露肝区情况下采集受试者肝脏右叶肋间切面图及肝右肾矢状切面图，见图1、图2，联合运用超声肝脏回声衰减和肝肾回声比值这2 项定量参数估算肝脏脂肪含量，以超声定量肝脏脂肪含量9.15%作为诊断脂肪肝的切点[12]。

图1 肝脏右叶肋间切面图Fig.1 Sagitta plane of right liver and kidney

图2 肝右肾矢状切面图Fig.2 Intercostal view of right lobe of liver

1.4 TMAO 及其前体代谢物检测

采集研究对象清晨空腹静脉全血2～3 mL，在4 ℃、3 000 r/min 离心10 min 分离出血清，取200～300 µL 分装于2 mL 冻存管，于-80 ℃冰箱保存备用。在提取代谢物后，通过用高效液相色谱-质谱分析（5500 QTRAP 质谱仪AB SCIEX）检测出TMAO 及其前体代谢物水平。

1.5 粪便DNA 提取及PCR 反应

基于本课题组前期研究[13]，用qRT-PCR 法检测粪便中目标细菌DNA 的表达量。收集研究对象的新鲜粪便标本200～300 mg，采用QIAGEN的 QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit 试剂盒，按照操作步骤提取样品DNA。

(四)对中国特色社会主义文化作了初步概括，奠定了中国特色社会主义文化是激励全党全国各族人民奋勇前进强大精神力量的初始基础

引物及内参序列，见表1，配制PCR 反应体系（总体积25 µL）。设置PCR 反应条件：直肠真杆菌、多行拟杆菌采用两步法进行反应，95 ℃10 min 为预变性阶段，95 ℃ 15 s、65 ℃ 1 min 为PCR 扩增阶段，共40 次循环；双歧杆菌反应条件为：95 ℃ 5 min 为预变性阶段，95 ℃ 15 s 溶解、60 ℃ 1 min 退火、72 ℃ 45 s 延伸为PCR 扩增阶段，共35 次循环；乳酸杆菌反应条件为：95 ℃ 10 min为预变性阶段，95 ℃ 15 s、61.6 ℃ 1 min 为PCR扩增阶段，共35 次循环；内参GAPDH 反应条件为：95 ℃ 30 s 为预变性阶段，95 ℃ 45 s 溶解、61 ℃ 30 s 退火、72 ℃ 34 s 延伸为PCR 扩增阶段，共40 次循环。待反应结束后，分析溶解曲线和扩增曲线，结果使用软件以2-△△Ct法进行相对基因表达分析，各目标菌群扩增曲线，见图3。

表1 引物及内参序列Tab.1 The sequences of primer and internal reference

图3 肠道目标菌群PCR 扩增曲线图Fig.3 The real-time PCR curve of the target intestinal flora

1.6 统计学处理

数据运用SPSS 26.0 和Graphpad Prism 9 统计软件进行统计学分析和图形制作。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，2 组数据间比较采用t检验；不符合正态分布的计量资料以中位数（P25，P75）表示，数据间比较采用非参数秩和检验；等级资料使用非参数秩和检验分析；相关分析采用Pearson 相关性分析；以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象基本信息及一般临床指标比较

NAFLD 组与健康对照组相比，年龄、BMI、腰围、臀围、FPG、HbA1C、HOMA-IR、TG、ALT、γ-GGT、TBA、UA、GFR 升高，HDL-C降低，差异有统计学意义（P<0.05）；2 组间性别、TC、LDL-C、AST 差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 2 组受试者的一般临床指标比较 [M（P25，P75）/ ]Tab.2 Comparison of the general data between the two groups [M（P25，P75）/ ]

表2 2 组受试者的一般临床指标比较 [M（P25，P75）/ ]Tab.2 Comparison of the general data between the two groups [M（P25，P75）/ ]

*P <0.05。

2.2 研究对象TMAO 及其前体代谢物比较

与健康对照组相比，NAFLD 组TMAO、TMA及胆碱水平均明显高于健康对照组（P<0.05）。但2 组间甜菜碱和左旋肉碱的水平差异无统计学意义（P>0.05），见表3。进一步对2 组肝脏脂肪含量与TMAO、TMA 及胆碱进行相关性分析，发现肝脏脂肪含量与TMAO 的水平具有正相关性（P<0.05），见表4。

表3 2 组受试者TMAO 及其前体代谢物比较 [M（P25，P75）/ ]Tab.3 Comparison of TMAO and its precursor metabolites between the two groups [M（P25，P75）/ ]

表3 2 组受试者TMAO 及其前体代谢物比较 [M（P25，P75）/ ]Tab.3 Comparison of TMAO and its precursor metabolites between the two groups [M（P25，P75）/ ]

*P <0.05。

表4 肝脏脂肪含量与TMAO、TMA 及胆碱相关性Tab.4 Correlation between liver fat content and TMAO，TMA and choline

2.3 研究对象肠道目标菌群表达量比较

与健康对照组相比，NAFLD 组乳酸杆菌、直肠真杆菌表达量明显增多，差异有统计学意义（P<0.05）；双歧杆菌、多形拟杆菌数量明显减少，差异有统计学意义（P<0.05），见表5。

表5 2 组受试者4 种肠道菌群表达量比较 [M（P25，P75）]Tab.5 Comparison of the expression levels of intestinal microbiota in the two groups [M（P25，P75）]

2.4 研究对象TMAO 和肠道菌群之间的关系

将4 种肠道菌群表达量的计算结果与TMAO水平进行相关性分析，结果显示TMAO 水平与直肠真杆菌表达量呈正相关（r=0.280，P<0.05），与双歧杆菌的表达量呈负相关（r=-0.332，P<0.05），与乳酸杆菌、多形拟杆菌表达量无明显相关（P>0.05），见表6。

2.5 研究对象饮食结构比较

对研究对象饮食结构问卷的结果进行差异分析（等级以A=4，B=3，C=2，D=1 进行分析），结果显示NAFLD 组与健康对照组受试者在膳食搭配、每周食用鱼类频率的差异上有统计学意义（P<0.05），其余饮食结构无明显差异（P>0.05），见表7。进一步对饮食结构与肝脏脂肪含量进行相关性分析发现，肝脏脂肪含量越高，受试者膳食搭配上荤菜占比越多（r>0，P<0.05），每周食用鱼类的次数越少（r<0，P<0.05），见表8。

表7 饮食结构在2 组间的差异Tab.7 Differences in dietary structure between the two groups

表8 肝脏脂肪含量与饮食结构的相关性（n=118）Tab.8 Correlation between liver fat content and diet structure（n=118）

3 讨论

许多证据表明，肝脏和肝外脂质代谢异常是NAFLD 进展过程中的中心驱动因素[14]，血脂异常是NAFLD 的共同代谢特征，其特征为TG 升高、HDL-c 降低、LDL-c 升高[15]。NAFLD 与肥胖密切相关，肥胖人群中NAFLD 的患病率及其危险因素已经引起了相当大的关注[16]。

本研究结果显示，NAFLD 患者年龄、BMI、腰围、肝功能、血脂、尿酸、糖代谢指标明显异常，提示年龄、BMI、腰围、血脂异常都是NAFLD 的危险因素，与糖脂代谢密切相关，肝脏脂肪堆积影响肝功能，特别是ALT 和GGT，可促进NAFLD 的进展。与健康对照组相比，NAFLD组胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）明显升高，进一步验证了胰岛素抵抗在NAFLD 发病机制中发挥重要作用。在饮食结构方面，若荤菜比例较高、鱼类等白肉较少的饮食可能促进NAFLD 发展。

目前NAFLD 的临床诊断涉及各种程序，如血液检查、B 超、瞬时弹力描记术和MRI，但在临床实践中很难区分非特异性症状（HBV 相关肝炎、酒精性肝炎和肝硬化），这表明临床应用中仍然需要有效和可重复的生物标志物[17]。

TMAO 作为肠-肝轴的代谢产物，对心脑血管疾病、慢性肾脏病等疾病的影响得到越来越多证据的支持[18-19]，而与NAFLD 关系的研究相对较少。Flores-Guerrero JL 等[20]发现血浆TMAO 浓度与NAFLD 患者的全因死亡率相关。在本研究中，NAFLD 组相比健康对照组TMAO 及前体物质TMA 水平明显增高，且TMAO 水平与肝脏脂肪含量呈正相关性，显示血清TMAO、TMA 水平与NAFLD 的存在和严重程度存在不良关联，推测TMA/FMO3/TMAO 作为肠道菌群驱动的一个通路，可能促进NAFLD 进展。

有研究显示，TMAO 可能是通过降低总胆汁酸池大小、限制胆汁酸的肠肝循环；并通过改变胆汁酸的合成和运输来逆转胆固醇运输、葡萄糖和能量平衡的方向，影响肝脏胰岛素抵抗及脂质沉积，从而导致脂肪组织炎症反应[21-22]。

胆碱作为人体必需的营养物质，具有多种生物学功能，参与多个体内代谢过程，如果膳食摄入胆碱减少、胆碱内源性生物合成受损，或胆碱的生物利用度降低，都会增加肝内脂质，导致脂肪肝形成[23]。在本研究中NAFLD 组相比健康对照组，血清胆碱水平明显升高，推测NAFLD 患者可能是胆碱生物利用度降低，导致肝脏脂质堆积。

大量临床和动物研究表明，NAFLD 的发展与肠道微生物群失调密切相关，其中厚壁菌门和拟杆菌门之间的平衡改变发挥重要作用，多种菌参与调节肠道内TMA 的合成[24-25]。Cho C.E 等[26]研究显示，血清TMAO 水平较高的人群厚壁菌门与拟杆菌门的比值增高，而TMAO 水平较低人群的厚壁菌门与拟杆菌门比值减小。本课题组前期研究也发现了肠道菌群结构在NAFLD 患者的改变，其中乳酸杆菌、直肠真杆菌数量明显增多，双歧杆菌、多形拟杆菌数量明显减少，其中多形拟杆菌为拟杆菌门代表菌，直肠真杆菌为厚壁菌门代表菌[13]，本次研究结果与之相符。笔者研究还发现血清TMAO 水平与直肠真杆菌表达量存在正相关性，与双歧杆菌存在负相关性，2 种菌群都只是各种所属菌门中的1 种，这可为我们探索TMAO 与各菌门之间关系提供依据和方向。

本研究的不足之处：首先，TMA/FMO3/TMAO作为一个物质代谢通路，本研究仅检测了研究对象血清TMA 和TMAO 的水平，未能采集到足够的肝脏样本检测肝组织FMO3 表达水平。其次，TMAO 及其前体代谢物水平受饮食因素影响较大，笔者进行饮食结构问卷上着重调查受试者日常的饮食结构，未明确到取样前的饮食摄入种类及量，未能更好体现TMAO 及其前体代谢物与饮食的关系。另一方面，在本研究中纳入的健康对照组例数较少，在今后的研究中需要更多的证据支持，进一步探索TMAO 在NAFLD 中的作用。

综上所述，肠-肝轴是NAFLD 发生和发展的关键组成部分，连接肠道微生物群和肝脏的确切机制是复杂的，且肠-肝轴的靶向性一直是代谢性疾病的焦点，并可能成为未来预防和治疗NAFLD 的当务之急，值得进一步深入研究。以TMAO 为靶点探索NAFLD 的防治手段，首先推荐改善生活方式和控制饮食，饮食成分是增加人体循环中TMAO 及其前体代谢物水平的最重要因素之一，合理的膳食搭配可能对NAFLD 起到积极的影响。从TMAO 生成的途径看，肠道微生物群在其中起到至关重要的作用，可将改变肠道菌群的组成作为策略，同时，抑制TMA/FMO3/TMAO途径有望成为治疗NAFLD 的新靶点。