基于主成分分析和灰色关联度法的白及UPLC特征图谱及不同商品规格等级质量研究*

杨晓东，邓成程，杨文惠，王 玥，肖健平，聂 寰，张 妍，古楚莹

（1.湖南一方天江药业有限公司，湖南 常德 415000；2.广东一方制药有限公司，广东 佛山 528244）

白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb. f.为兰科多年生草 本植物，始载于《神农本草经》。其药用历史悠久，具有收敛止血、消肿生肌的功效[1]，临床常用于咯血、外伤出血、疮疡肿毒等。白及主要分布于湖南、贵州、湖北、安徽等省份，其他各地均有少量栽培[2]。白及主要含有联苄类、二氢菲类、菲类、联菲类等成分[3-4]，为常用名贵药材，市场需求巨大，野生资源十分匮乏[5]。市场上流通的白及大多为统货，白及药材商品规格等级标准亟待更新。

目前，市场中药材等级规格划分主要以性状外观来评价中药材优劣[6-7]，是影响中药材市场价格的重要因素。白及属于块茎类中药材，在中药材分级过程中常以重量大小为依据[8]，一般认为重量越大，质量越好，反之则较差。但有相关研究表明川芎、天麻、太子参等药材指标性成分质量分数与大小成正相关[9-11]，白芍、桔梗等药材指标性成分质量分数与大小无明显相关性[10-11]，因此，仅通过药材重量大小来划分药材等级较为片面，往往不能很好地反映中药材的内在质量。中药材商品规格等级划分应综合考虑成分等其他因素。

本研究以白及不同商品规格为研究对象，建立超高效液相色谱（UPLC）特征图谱，结合主成分分析和灰色关联度模型，旨在为白及的质量评价和规格等级的建立提供合理建议。

1 材 料

1.1 仪器 Waters H-Class型超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；SQP型万分之一天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；SB25-12DTS型数控超声波清洗器（宁波新芝生物科技股份有限公司）。

1.2 试剂与试药 1,4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯（批号：112061-202102，含量：95.5%）购自中国食品药品鉴定研究院；甲醇为分析纯，磷酸、乙腈为色谱纯；水为超纯水。

实验室共收集16批白及药材，经湖南一方天江药业有限公司孙冬梅教授鉴定，均为兰科植物白及Bletilla striata（Thunb.）Reichb. f.的干燥块茎[1]，且符合2020年版《中华人民共和国药典》白及项下的各项规定。根据产地、市场和文献调研将白及分为3个等级，详细信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Waters BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～4 min，5%A→18%A；4～10 min，18%A→28%A；10～16 min，28%A →40%A；16 ～20 min，40%A →55%A；20 ～22 min，55%A→55%A）；流速为0.35 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为280 nm；进样量为4 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取1,4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯对照品适量，精密称定，置于容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含1,4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯0.15 mg的对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取白及药材粉末（过三号筛）约0.2 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 mL，称定质量，超声处理（功率：300 W，频率：40 kHz）30 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 特征图谱方法学考察

2.3.1 精密度试验 取白及药材粉末（过三号筛，编号：S2），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，以4号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于2.0%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取白及药材粉末（过三号筛，编号：S2），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于0、2、4、8、12 h进样测定。以4号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.3.3 重复性试验 取白及药材粉末（过三号筛，编号：S2），按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，以4号峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均小于3.0%（n=6），表明方法重复性良好。

2.4 特征图谱的建立及相似度评价 取16批白及药材按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测。将色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版），设定S1为参照图谱，自动匹配后多点校正，进行全谱峰匹配，生成叠加图谱。（见图1）共确认9个特征共有峰，通过与对照品比对，指认4号峰为1,4-二[4-（葡萄糖氧）苄基]-2-异丁基苹果酸酯，以保留时间适中、峰面积较大的4号峰作为参照峰（S）[12]。（见图2）相似度结果见表2。各批次样品与对照图谱的相似度均大于0.725，一等品白及和二等品白及之间的相似度为0.503～0.996，一等品白及与三等品白及之间的相似度为0.515～0.988，二等品白及与三等品白及之间的相似度为0.393～0.985，由此可见，不同商品规格等级间的白及存在一定的差异性。

图1 16 批不同商品规格等级白及特征图谱

图2 特征图谱共有峰的指认

表2 相似度结果

2.5 主成分分析 将16批白及样品特征图谱中的9个共有峰的峰面积/称样量导入SPSS 20.0软件[13]，进行主成分分析，得出相关矩阵的特征值及其方差。（见表3）由表3可知，前2个成分的特征值大于1，即4.463和2.811，对总方差的累积贡献率达80.817%，具有很好的代表性，可显示白及特征图谱共有峰的大部分信息。同时结合观察碎石图（见图3）可知，图中曲线有明显拐点，说明前2个成分显示出白及药材间的大部分信息。成分矩阵见表4。由表4可知，第1主成分主要反映了白及特征图谱峰2、峰4、峰5、峰6和峰8的信息，第2主成分主要反映了白及特征图谱峰1、峰3、峰7和峰9的信息。

图3 主成分分析碎石图

表3 特征值及累积方差贡献率

表4 主成分分析矩阵

采用SPSS 20.0软件对上述主要成分载荷值进行分析，以各自主成分载荷向量除以各自主成分特征值的算术平方根得到主成分系数[14]，各主成分的线性模型如下：F1=-0.055X1+0.454X2-0.087X3+0.385X4+0.458X5+0.450X6-0.074X7+0.453X8-0.118X9；F2=0.390X1-0.058X2+0.548X3+0.233X4+0.009X5+0.080X6+0.545X7+0.119X8+0.410X9，F =0.496F1+0.312F2。其中，F1、F2分别表示第1、2个主成分得分，F表示综合得分，X1～X9分别表示9个共有峰峰面积的标准化数据。计算后，得到各批白及样品的综合得分。（见表5）整体而言，一等品白及得分最低，三等品白及得分最高。

表5 综合得分排序

2.6 灰色关联度 为了进一步探究不同商品规格等级白及的质量差异，采用灰色关联度分析法对不同商品规格等级白及进行质量评价。设有m个总样本，每个样本n个评价指标，由此组成的一个评价单元序列｛Xik｝（i=1、2、3、4…m；k=1、2、3、4…n；在本研究中i=16，k=9）。

2.6.1 标准化处理 由于样本不同指标之间量纲不统一，故需对原始数据进行变换处理[15]，处理公式为Yik=Xik/Xk（Yik为标准化处理后的数据，Xik为原始数据，Xk为第m个样品第k个指标的均值）。

2.6.2 关联系数的计算 灰色关联度最优参考序列和最差参考序列[16]分别为｛XSK｝和｛Xtk｝（k=1，2，3…n）。计算各评价单元相对于最优、最差参考序列的关联系数。

相对于最优参考序列的关联系数计算公式如下：

式中，Δmin=min|Yik-Ysk|，Δmax=max|Yik-Ysk|，（i=1，2，3…m）；ρ为0.5。相对于最差参考序列的关联系数计算公式如下：

式中，Δ'min=min|Yik-Ytk|，Δ'max=max|Yik-Ytk|，（i=1，2，3…m），Ytk为各个成分对应Yik的最大值；ρ为0.5。

2.6.3 关联度和相对关联度的计算 相对于最优参考序列的关联度为：

相对于最差参考序列的关联度为：

评价单元的相对关联度计算公式如下：

根据相对关联度的大小对评价单元序列进行排序，得到质量排序结果[17]。结果见表6，不同商品规格等级的白及存在差异性，整体而言，三等品白及得分最高，一等品白及得分最低。

表6 不同商品规格等级白及相对关联度

3 讨 论

本研究采用梯度洗脱，在前期实验中对比了甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液等流动相，最终选定乙腈-0.1%磷酸溶液为流动相。在上述条件下，色谱峰分离度和理论板数等均较好。本研究通过单因素试验系统考察了提取溶剂、提取方法及提取时间对整体色谱峰的影响。当溶剂为80%甲醇、料液比为1∶50（g/mL）、超声时间为30 min时，提取效率和峰型较好，故选择上述方法作为白及药材的提取方法。

中药指纹/特征图谱等多指标成分整体质量控制已成为中药质量控制必然发展趋势[18-19]。化学模式识别的方法与指纹/特征图谱分析相结合，能准确判断白及不同商品规格等级之间的差异，可以作为初步判断中药材质量优劣的判别标准[20]。本研究以白及药材特征图谱的9个共有峰为指标，对比相似度可知不同商品规格等级的白及间存在明显差异，结合主成分分析与灰色关联度对不同商品规格等级的白及样品进行质量评价研究。结果显示三等品白及得分最高，质量最好，一等品白及得分最低，质量最差。原因可能与白及的生长方式有关，不同年份的白及通过分叉茎连接，上一年生的白及需要为后续白及生长提供部分营养[21]。另一方面随着社会的进步，农业的发展，现在中药材生产中存在不科学施用化肥、激素、农药等促进药材高产的现象，导致药材性状发生显著变化，体现为中药材个头增大、种植年限缩短。但中药材也不能单以重量较小的入药，容易造成药材资源浪费的同时还会降低农民种植的积极性，不利于中药行业的健康发展。因此，需要对白及的大小、采收时间和药材质量等多个方面进行综合考量，以期为白及药材的质量控制及种植采收提供理论指导，而且对于白及规范化种植、提升药材质量和临床疗效也有积极的意义。