基于网络药理学与分子对接预测川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化的作用机制

赵丽娟，曹文慧，翟率宇，韩立坤，白海花

（1.内蒙古民族大学生命科学与食品学院，内蒙古 通辽 028043；2.内蒙古民族大学附属医院，内蒙古 通辽 028000）

心血管疾病是全球致死率最高的一种疾病，每年死于该病的人数占全球死亡总数的31%［1］，近年来，由于人口老龄化的不断增加，心血管疾病患者也在逐年增加。高甘油三酯血症作为一种临床常见的血脂异常表现为体内甘油三酯水平的异常升高，升高的甘油三酯水平是心血管疾病的重要危险因素［2］，而动脉粥样硬化则是导致其发生的主要病理过程［3］。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种慢性炎症性疾病，血管内会出现脂质的聚集和易损斑块［4］，对动脉粥样硬化的防治很有必要，目前主要是通过他汀类药物控制血脂、阿司匹林抗血小板凝集等方式进行治疗。从中国传统医学角度探讨动脉粥样硬化，将其归为“中风“”胸痹”等范畴［5］，而高血脂作为其主要致病因素与中国传统医学中的“痰浊”等致病学说的阐述具有相似之处［6］。川芎（Ligusticum chuanxiong Hort）是伞形科草本植物，取用干燥根茎［7］，主要分布于四川，云南、内蒙古等省区也有少量种植。赤芍（Paeoniae lactiflora Pall）来源于毛茛科植物芍药的干燥根［8］，主要来自内蒙古、辽宁、山西等省区。川芎性质温和、味道辛辣，能够活血行气，祛风止痛。赤芍性质微寒、味道微苦，清热凉血，散瘀止痛。川芎-赤芍药对作为活血化瘀药对被广泛应用于调节血管再生，目前已有研究发现，它们对动脉粥样硬化小鼠发挥了治疗作用［9-10］，然而具体的作用机制尚不完全明确，本研究以川芎-赤芍药对和动脉粥样硬化为研究对象，通过中药整合药理学研究平台推测川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化可能的作用机制，旨为川芎-赤芍药对在临床上治疗动脉粥样硬化的应用奠定一定的药理基础。

1 材料与方法

1.1 川芎-赤芍有效成分、成分靶点的获取

TCMSP 数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中使用口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及药物相似性（drug-like，DL）≥0.18作为条件来筛选川芎、赤芍两味草药的有效成分和对应靶点，并使用Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）转换数据信息。以川芎、赤芍及其各自对应的有效成分、成分靶点作为节点，使用Cytoscape3.8.2软件进行可视化，构建川芎-赤芍药对的“有效成分-靶点”网络，并筛选核心成分。

1.2 动脉粥样硬化疾病靶点及靶点交集的获取

用OMIM 数据库（https：//www.omim.org/）和GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）查找动脉粥样硬化靶点，并通过Uniprot数据库进行信息转换，然后将上述获得的药物成分靶点及动脉粥样硬化靶点导入Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），获得川芎-赤芍药对对动脉粥样硬化产生治疗作用的候选靶点Venny图。

1.3 靶蛋白互作网络的构建

将药对治疗动脉粥样硬化的候选靶点使用String 数据库（https：//cn.string-db.org/）来构建川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化的靶蛋白互作网络（Protein-Protein Interaction Networks，PPI），设定物种为人类、最低相互作用阈值为0.4，得到靶蛋白间相互作用关系，将TSV格式的结果文件利用Cytoscape 3.8.2软件可视化，进行靶点间网络分析，筛选川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化的核心靶点。

1.4 GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析

使用Metascape数据库（https：//metascape.org）对川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化疾病的候选靶点进行GO及KEGG富集分析，然后利用RStudio 4.1.3软件的ggplot2包以气泡图形式展示候选靶点主要参与的生物学过程和有关的信号通路。

1.5 川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化“成分-靶点-通路”网络的构建

再次利用Cytoscape3.8.2软件以药物治疗疾病的候选靶点、对应的有效成分、疾病名称和信号通路为节点，构建川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化“有效成分-靶点-通路”网络，展示药物有效成分、药物治疗动脉粥样硬化的候选靶点及信号通路间的相互作用关系。

1.6 分子对接

利用PDB（https：//www.rcsb.org）数据库下载核心成分的3D 结构，TCMSP 数据库下载核心靶点的3D结构，将靶点大分子导入PyMOL 2.4.0 软件去掉水及配体后使用AutoDock Tools 1.5.6 软件对其加氢、计算电荷数及确定刚性性质，然后在AutoDock Tools 1.5.6软件进行核心成分与核心靶点的分子对接，得到药物成分小分子和靶点大分子的结合能，最后用PyMOL 2.4.0软件对结合部位进行可视化。

2 结果

2.1 川芎-赤芍有效成分及成分靶点的获取

使用TCMSP数据库筛选后得到川芎、赤芍的有效成分共35个，两者分别为7个及29个，有1个共同成分，见表1。

表1 川芎和赤芍的活性成分Tab. 1 Active ingredients of Ligusticum chuanxiong Hort and Paeoniae lactiflora Pall

筛选得到的活性成分对应靶点分别为川芎靶点30个、赤芍靶点102个，通过去重处理后，共得到106个川芎-赤芍靶点。将有效成分与靶点收集筛选后进行数据处理，通过Cytoscape 3.8.2软件获得川芎-赤芍药对的“有效成分-靶点”网络，见图1，展示出了川芎-赤芍药对多成分、多靶点的特点，分析所得度值（Degree）越大有效成分的形状越大，其与对应靶点的关联性越多，其有效成分作用也越大，将度值前4位的成分筛选为核心成分，分别为β-谷甾醇（CS8，度值39）、黄芩素（CS6，度值38）、豆甾醇（CS6，度值30）和杨梅酮（CX2，度值26）。

图1 川芎-赤芍药对的“有效成分-靶点”网络Fig. 1 The“active ingredient-target”network of Ligusticum chuanxiong Hort-Paeoniae lactiflora Pall drug pair

2.2 动脉粥样硬化疾病靶点及靶点交集的获取

使用OMIM数据库和GeneCards数据库查找动脉粥样硬化靶点，去重后得到动脉粥样硬化对应靶点2467 个。将筛选后的106 个成分靶点与2467 个疾病相关靶点导入Venny2.1.0 软件，得到58 个共同靶点，为川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化的候选靶点，见图2。

图2 川芎-赤芍药对-动脉粥样硬化共同靶点韦恩图Fig. 2 Venn diagram of common targets of Ligusticum chuanxiong Hort-Paeoniae lactiflora Pall drug pair- atherosclerosis

2.3 靶蛋白互作网络的构建

将58个共同靶点应用String 数据库得到相互作用节点的靶蛋白-蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI），然后将String数据库得到的结果文件导入Cytoscape 3.8.2软件去除落单靶点后绘制更为清晰简洁的PPI图，见图3，靶点的大小与度值成正比，将度值前4的靶点筛选出来作为核心靶点，分别为AKT1（蛋白激酶B，度值41）、TNF（肿瘤坏死因子，度值41）、VEGFA（血管内皮生长因子A，度值35）和TP53（肿瘤蛋白p53，度值34）。推测这些靶点可能为川芎-赤芍药对对动脉粥样硬化起到主要作用的靶点。

图3 川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化的候选靶点PPI网络Fig. 3 PPI network of candidate targets for the treatment of atherosclerosis with Ligusticum chuanxiong Hort-Paeoniae lactiflora Pall drug pair

2.4 GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析

使用Metascape 数据库，进行候选靶点的GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。GO富集分析得到461个生物学条目（P＜0.01），根据P值展示了前20条，见图4，包括对氧水平下降的反应、对细菌来源分子的反应、对激素的反应、循环系统过程、磷酸化的正调控等生物学过程。KEGG 富集分析筛选出信号通路137条（P＜0.01），根据P值展示了前20条，见图5，居首位的通路有癌症信号通路、脂质和动脉粥样硬化通路、化学致癌-受体激活通路等，提示川芎-赤芍药对主要通过这些生物学过程和信号通路对动脉粥样硬化产生作用。

图4 川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化的潜在靶点GO分析Fig. 4 GO analysis of potential targets of Ligusticum chuanxiong Hort-Paeoniae lactiflora Pall drug pair in the treatment of atherosclerosis

图5 川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化的潜在靶点KEGG分析Fig. 5 KEGG analysis of potential targets of Ligusticum chuanxiong Hort-Paeoniae lactiflora Pall drug pair in the treatment of atherosclerosis

2.5 川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化“成分-靶点-通路”网络的构建

将上述得到的药物治疗疾病的候选靶点、对应的药物有效成分、疾病名称和信号通路输入到Cytoscape3.8.2 软件，构建川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化“成分-靶点-通路”网络，见图6，结果展示了川芎-赤芍药对多种有效成分以协同的形式与多个交集靶点、多种信号通路间的相互作用。

2.6 分子对接

对核心成分β-谷甾醇、黄芩素、豆甾醇、杨梅酮和核心靶点AKT1（PDB ID：7MYX）、TNF（PDB ID：1TNF）、VEGFA（PDB ID：4KZN）、TP53（PDB ID：2PCX）分别使用AutoDock Tools 1.5.6软件进行了分子对接，结合能越低说明受体和配体间亲和力越高，结合的结果越可靠，结果见表2，各核心成分和核心靶点的结合能分布在-7.14～-4.61之间，均具有较好的结合能力。将每个核心成分与其结合能力最高的靶点利用PyMOL 2.4.0软件对结合部位进行可视化，见图7。

图7 4种核心成分与靶点对接结果Fig. 7 Docking results of four core components with targets

3 讨论

动脉粥样硬化是一种临床常见疾病，炎症是导致其发生的首要因素。中国传统医学的发展较为成熟，探究川芎-赤芍药对对动脉粥样硬化病理状态形成过程起到的作用存在现实意义。本研究基于网络药理学对川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化可能的作用机制进行了研究预测，筛选出来的35个活性成分对应的靶点与动脉粥样硬化靶点基因取交集后得到了与动脉粥样硬化有关的候选靶点58个，川芎-赤芍药对的“有效成分-靶点”网络展现了其多种成分和多个靶点间的相互作用，而其核心成分β-谷甾醇、黄芩素、豆甾醇、杨梅酮与核心靶点AKT1、TNF、VEGFA、TP53间的分子对接结果表明了较好的结合能力，证明川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化的可行性。

AKT编码的蛋白激酶B是一种丝-苏氨酸蛋白激酶，它共分为3个亚型，其中AKT1主要促进细胞的存活和增殖。PI3K是AKT活性的主要调节物，PI3K-AKT通路能被细胞内的多种刺激因子所活化，包括VEGF，而AKT的过度活化与肿瘤等多种疾病均相关［11］。研究发现，ATK1可使血清中游离的胆固醇和甘油三酯水平明显下降，并且使内毒素诱导单核细胞/巨噬细胞内促炎介质的分泌减少，有力地证明了AKT1基因靶点在脂质代谢及炎症调节中起着重要作用［12］。TNF编码的肿瘤坏死因子是一种多功能的调节因子，参与调节包括细胞增殖和细胞凋亡等多种生物学过程［13］，而TP53编码的肿瘤蛋白p53是一种肿瘤抑制蛋白，它可以保持基因的稳定性，也能够调控细胞的生长发育周期［14］，通过调控细胞周期来有效防止疾病的发生。此外，TP53诱导的糖酵解和凋亡调控因子（TIGAR）能够有效减少糖酵解并保护机体免受氧化应激，与心血管疾病存在密切关联［15］，且已有研究发现，TIGAR能够通过减少活性氧（ROS）的产生来减轻氧化还原损伤，进而来调节动脉粥样硬化的发生及发展［16］。VEGFA（血管内皮生长因子A）主要作用于内皮细胞，影响血管的生成和通透性，在血管稳态中起到了关键作用［17］。对候选靶点进行的GO分析和KEGG 分析结果及构建的川芎-赤芍药对治疗动脉粥样硬化“有效成分-通路-交集靶点-动脉粥样硬化”网络展现了川芎-赤芍药对多成分、多靶点、多通路的作用特点，显示了多个通路间直接或间接的联系，对血脂的代谢和细胞的生长发育发挥了正向作用，从而对动脉粥样硬化的炎症反应起到了调控作用。

综上所述，采用川芎-赤芍药对对动脉粥样硬化进行防治，涉及多成分、多靶点和相互关联的多条信号通路，通过对这些基因靶点和信号通路进行研究，了解川芎-赤芍药对成分可能对动脉粥样硬化发挥的作用，为该药物在临床的应用奠定一定的理论基础。