木豆WD40基因家族鉴定及响应茉莉酸甲酯的表达分析

牛禹极 吴锦林 陈耀阳 林岩松 杨杰 付玉杰

摘要：WD40蛋白參与调控植物生长发育、次生代谢产物合成及胁迫应答等生物学过程。WD40主要作为MYB-bHLH-WD40（MBW）蛋白复合体成员之一，激活花青素合成下游基因转录进而促进花青素的积累。探究WD40基因家族的功能是解析黄酮类次生代谢产物代谢调控机制的关键环节。本研究基于木豆（Cajanus cajan）基因组鉴定了木豆CcWD40家族成员，并对CcWD40基因进行生物信息学分析以及对茉莉酸甲酯响应的实验。利用生物信息学在木豆基因组中鉴定出116个CcWD40基因家族成员，系统全面地评价了候选基因的基因结构、染色体分布、启动子顺式作用元件及系统发育进化历程等特征，并分析了其在茉莉酸甲酯处理下的表达模式。结果表明：WD40蛋白质包含的氨基酸残基数目在296～1 709之间，等电点范围为4.33～9.58；116个基因可进行定位的基因有68个，这68个CcWD40基因不均匀分布于11条染色体上，大多位于3号染色体；系统进化树将木豆CcWD40家族成员分为18个亚家族，尽管其基因结构间内含子差异较大，但在进化树同一分支中的较为相似；共线性分析显示，在所选3种模式植物中，木豆与大豆亲缘关系最近；木豆CcWD40基因具有多个响应元件，包括胁迫响应元件、发育响应元件和激素响应元件，如脱落酸响应元件（ABRE）、水杨酸响应元件（TCA-element）、赤霉素响应元件（GARE-Motif）等，可见它们的表达受到复杂的调控网络的控制，可能在非生物胁迫中起到重要作用；基于RNA-seq数据分析木豆CcWD40家族基因应茉莉酸甲酯的表达特征，其中96个CcWD40基因的表达量会在MeJA处理后首先逐渐降低，只有20个CcWD40基因的表达量会首先呈现升高趋势，并且同一进化分支的CcWD40基因相应趋势大体相同。该研究将为进一步探索WD40基因在调控黄酮类化合物合成和响应非生物胁迫应答中的功能提供重要基因资源和理论基础。

关键词：木豆；CcWD40；全基因组鉴定；茉莉酸甲酯

中图分类号：中图分类号Q753文献标志码：A文献标识码

Identification of WD40 gene family in pigeon pea and their expression pattern

responded to Methyl Jasmonate

NIU  Yuji1，WU  Jinlin1，CHEN  Yaoyang1，LIN  Yansong1，YANG  Jie2，FU  Yujie3*

（1 Aulin College， Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040，China; 2 College of Chemistry，

Chemical Engineering and

Resource Utilization， Northeast Forestry University，Harbin，Heilongjiang 150040，China;

3 College of Forestry， Beijing Forestry University，Beijing 100083，China）

Abstract： WD40 protein is mainly involved in the regulation of biological processes such as the growth and development of plant， synthesis of secondary metabolites and stress responses. WD40， as one of the MYB-bHLH-WD40 （MBW） protein complexes， activates the transcription of genes which are located downstream of synthesis to promote anthocyanin accumulation. Exploring the function of WD40 gene family is the key procedure to analyze the metabolic regulation mechanism of flavonoid secondary metabolites. In this study， based on the pigeon pea （Cajanus cajan） genome， the members of CcWD40 family genes were identified in pigeon pea， and the CcWD40 genes and its responses of Methyl Jasmonate were analyzed by bioinformatics and experiments respectively. With bioinformatics， 116 members of the CcWD40 gene family were identified in the genome of pigeon pea， and the characteristics of the gene structure， chromosome distribution， cis-acting elements of the promoters， and the evolutionary history of the candidate genes were systematically and comprehensively evaluated， and the expression pattern disposed by Methyl Jasmonate was analyzed. The results showed that the amino acid residues of WD40 proteins ranged from 296 to 1 709， and the isoelectric point range was from 4.33 to 9.58; 68 of the 116 genes could be mapped， and these 68 CcWD40 genes were unevenly distributed on 11 chromosomes， mostly located on chromosome 3; the phylogenetic tree divides the members of the pigeon pea CcWD40 family into 18 subfamilies. Although the introns of the CcWD40 gene structure differ greatly， they are relatively similar in the same branch of the evolutionary tree; collinearity analysis shows pigeon pea is the closest relative to soybean among these 3 model organisms; pigeon pea CcWD40 has multiple response elements， including stress response elements， developmental response elements and hormone response elements， such as abscisic acid response element （ABRE），salicylicacid response element （TCA-Element）， gibberellin response element （GARE-Motif）， etc. It can be seen that their expression is controlled by a complex regulatory network which may play an important role in abiotic stress; it is supposed that based on RNA-seq data analysis， the pigeon pea CcWD40 family genes significantly responded to the disposal of Methyl Jasmonate， in which 96 CcWD40 genes will express less while 20 ones express more and the CcWD40 genes located at the same branch of evolution share the similar responsive tendency. This study will provide important genetic resources and theoretical basis for further exploring the function of WD40 gene in regulating the synthesis of flavonoids and responding to abiotic stress.

Key words： Cajanus cajan;CcWD40;genome-wide identification;Methyl Jasmonate

木豆（Cajanus cajan）种植于半干旱热带地区，因其具有重要的营养价值和药用价值而被广泛关注。其不同组织部位均被用于传统医学，抗氧化、抗糖尿病、抗菌、DNA损伤保护和黄嘌呤氧化酶抑制特性已被证实。木豆的多功能性归因于其富含的多种黄酮成分。然而，目前对于木豆黄酮生物合成途径及其代谢调控机制的研究较少。

黄酮在水果、蔬菜、坚果、种子和花卉中发挥多种生物功能，包括帮助细胞抵抗紫外线辐射及植物病原体侵袭，作为植物与微生物相互作用中的信号分子参与花粉的生长发育及根瘤器官形成的调控，吸引传粉者与影响花朵着色等。据报道，黄酮与人体健康密切相关，具有显著抗氧化、抗病毒和抗肿瘤的生物活性，对治疗糖尿病、痢疾和肝炎有显著疗效，其也被用于预防动脉硬化、治疗心血管疾病等。

据报道，黄酮的生物合成主要来自苯丙烷代谢途径，该途径已在多种模式植物中证实［1］。MBW三联复合物是黄酮类化合物合成关键酶基因的直接调控核心［2］。在这个三元复合体中，WD40作为复合体成员之一对于黄酮类化合物生物合成是必不可少且不可替代［3-4］，能增强复合物的活性［5］。拟南芥TTG1蛋白归属于WD40蛋白家族成员，TTG1-TT2-TT8形成复合体激活BANYULS（BAN）基因的表达来调控拟南芥种皮中黄酮的生物合成。TTG1通常作为bHLH的协同转录因子发挥作用，拟南芥TTG1能够结合bHLH转录因子（EGL3、GL3、TT8），和MYB转录因子（MYB113或MYB114、PAP1、PAP2）形成三联复合体来影响植物特异性组织中黄酮类化合物的积累，与TT2/TT8结合共同激活BANYULS（BAN）的转录［5］。

WD40蛋白质组成了1个多样化的蛋白质超家族。WD40结构域一般由多个WD40 repeat组成，常以β-螺旋桨的结构形式存在。WD40 repeat是44～60个氨基酸残基组成的重复单元，N端有1个WD（Gly-His）二肽，C端有1个WD（Trp-Asp）二肽［6］。WD40 repeat由1个四链反向平行的β-折叠构成，并通过氨基酸残基构成的氢键网络维持折叠结构的稳定性。通常5～8个WD40 repeat形成1个β-螺旋桨折叠结构，其中7个WD40 repeat形成的β-螺旋桨最为常见，也是理论上最理想的构型［6］。WD40蛋白一般只包含1个β-螺旋桨结构，部分WD40蛋白包含多个［7］。β-螺旋桨结构的稳定性主要通过桨叶之间的疏水作用力维持，且绝大部分β-螺旋桨结构域中还包含1个“尼龙搭扣”开关，用于进一步保证折叠的稳定性［8-9］。自首个WD40蛋白结构被鉴定以来，数十个WD40蛋白结构随后被鉴定［10-12］。1个完整的β-螺旋桨至少需含4个重复的WD40结构域。G蛋白的β亚基共含7个WD40结构域，其中第一个和最后一个参与形成相同的片段，这可能增强β-螺旋桨结构的稳定性。

茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate， MeJA）是1种重要的植物激素，可触发植物抵御害虫和病原体［13-14］，还影响许多植物发育过程，例如花青素的积累［15］。MeJA还是1种植物信号调节物质，可以激活植物体内CHS基因的表达［16］，进而促进黄酮类化合物的合成。另外，JAZ蛋白是黃酮类化合物生物合成的负调控因子。茉莉酸信号导致JAZ蛋白的降解，MYB-bHLH复合体的释放，并促进黄酮类化合物的生物合成［17］。

近些年，WD40基因相继在许多物种得到鉴定和研究，如紫苏、番茄、苹果、草葺、水稻等，这些物种中的WD40基因参与花青素的合成调控。但是尚无在木豆中对于WD40基因的研究。本研究利用全基因组分析筛选并鉴定木豆CcWD40基因家族成员，全面分析CcWD40蛋白的进化历程、基因结构、启动子作用元件等，研究CcWD40响应茉莉酸甲酯的表达模式。本研究为进一步验证木豆CcWD40基因的生物学功能及解析木豆黄酮合成代谢调控机制提供基因资源。

1 材料与方法

1.1 实验材料

木豆幼苗培养于东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室温室，温度设置为25℃，光周期设置为16h光照和8h黑暗。

1.2 实验方法

1.2.1 木豆CcWD40基因的鉴定及其生物信息学分析

从Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）下载WD40蛋白质的隐马尔可夫模型（PF0040），利用PF0040作为种子文件搜索木豆基因组数据库筛选获得木豆CcWD40基因家族的全部成员。为了验证所筛选基因的准确性，使用拟南芥WD40蛋白质进行序列比对，选择E-value值小于1×10-5的序列作为候选基因。根据基因在染色体上的分布将鉴定到的116个CcWD40蛋白命名为CcWD40-1至CcWD40-116。同时，通过ExPASy （https：//web.expasy.org/protparam/）分析CcWD40蛋白的理化性质，主要包括氨基酸数目、蛋白质分子量及等电点等。根据CcWD40基因的登录号在NCBI数据库中获知其染色体位置信息，利用TBtools生物软件绘制CcWD40基因家族在染色体上的分布。

1.2.2 木豆CcWD40基因的基因结构及启动子功能元件预测

CcWD40基因外显子和内含子相关基因结构信息通过基因组注释信息获得，为直观展现CcWD40基因家族的基因结构特征，利用TBTools软件进行可视化。木豆基因组数据库检索候选基因起始密码子上游的2 kb基因组DNA序列，并利用Plantcare网站预测CcWD40基因启动子顺式作用元件和功能位点以探究木豆CcWD40基因家族的转录调控机制。

1.2.3 木豆CcWD40蛋白发育进化及共线性分析

为明确CcWD40蛋白发育进化及分类，从NCBI数据库下载拟南芥AtWD40基因家族的全部成员，利用MEGA 5.1的NJ（Neighbor-joining）算法构建木豆和拟南芥WD40蛋白质系统发育树，检验次数为1 000，获得的进化树利用iTOL（https：//itol.embl.de/）进行修饰美化。使用TBtools软件中的MCscanX插件分析木豆、拟南芥、大豆和水稻基因组间的共线性关系，WD40家族基因突出显示，并绘制基因组间的共线性图谱。

1.2.4 木豆CcWD40基因在茉莉酸甲酯处理下表达模式分析

基于前期工作中茉莉酸甲酯处理木豆的转录组数据，分析116个CcWD40候选基因对茉莉酸甲酯的响应模式，通过FPKM（fragments per kilobase million）值以10为底的对数进行转化，归一化处理后绘制聚类热图。

2 结果与分析

2.1 木豆CcWD40基因家族鉴定及理化性质分析

通过全基因组筛选和生物信息学分析获得116个CcWD40家族成员，根据基因在染色体上的分布依次命名为CcWD40-1～CcWD40-116。为了鉴定CcWD40家族成员的基本特征，对CcWD40蛋白的理化性质进行分析。结果为CcWD40家族成员的氨基酸数目在296～1 709之间，相对分子质量在7211.9～191948.85之间，等电点范围为4.33～9.58（表1）。

2.2 木豆CcWD40基因家族的染色体定位

根据基因组注释信息获得CcWD40家族成员的染色体分布信息，从图1中可以看出，68个CcWD40基因家族成员不均匀的分布在木豆的11个染色体上。

其中分布于第三号染色体上CcWD40家族成员数目最多，共包括19个成员；第十一号和第二号染色体上分布的成员相对较多，分别检索到10个和9个成员；第五、六、八、九、十号染色体上分别检索到3、5、6、7和4个成员；第一号和第四号染色体上均包含2个成员，仅有1个CcWD40家族成员（CcWD40-41）分布到第七号染色体上。

2.3 木豆CcWD40基因家族的基因结构

分析69个CcWD40基因的结构组成（内含子和外显子的数量和分布），了解CcWD40蛋白的进化印记。基因结构分析表明（图2），CcWD40基因家族各成员之间的内含子数量及长度差异较大，在系统发育进化树中位于同一分支的各成员之间的基因結构相似性较高。例如，CcWD40-52、CcWD40-53和CcWD40-54在进化树中位于同一分支，均具有17个外显子和18个内含子；CcWD40-12和CcWD40-13具有20个外显子，在进化树中位于同一分支。这些结果说明，在物种进化过程中地位相近的基因具有相似的基因结构。

2.4 木豆CcWD40基因家族的进化及分类

为了研究CcWD40蛋白的进化关系，构建了拟南芥AtWD40蛋白和木豆CcWD40蛋白的系统发育树（图3）。木豆CcWD40蛋白被分成18个分支（Group 1～Group 18），每一个分支的蛋白质数量都有显著差异，其中Group 18家族成员最多。Group1、Group2、Group3、Group4、Group5、Group6、Group7、Group8、Group11、Group12、Group13、Group14、Group16、Group18分别包含5、4、2、2、3、2、3、2、2、4、9、3、7、17个成员；Group 9、10、15、17家族成员最少，仅包含1个成员。在每个Group中，木豆和拟南芥的WD40家族成员均有分布，这说明相较于拟南芥而言，木豆的WD40基因在进化过程中较为保守。

2.5 木豆CcWD40基因家族的共线性分析

为了探究CcWD40基因家族的进化机制，构建木豆与其他3种植物全基因组的共线性分析，包括2个双子叶植物（拟南芥和大豆）和1个单子叶植物（水稻）。结果如图4所示，木豆和水稻之间仅有2个共线性基因，木豆和拟南芥之间有23个共线性基因，木豆-大豆之间的共线性事件远大于木豆-拟南芥和木豆-水稻，证实了木豆与大豆的进化距离较近。

2.6 木豆CcWD40基因家族的启动子作用元件分析

为了探究CcWD40基因的调控机制，利用PlantCare数据库在线分析了CcWD40基因转录起始点上游2 kb序列，以确定潜在的顺式作用元件和功能位点。结果如图5所示，在CcWD40基因的启动子区域检测到多种顺式作用元件，包括胁迫响应元件、发育响应元件和激素响应元件（图5a）。这些结果表明，它们的表达受到复杂的调控网络控制。

对于胁迫相关顺式作用元件，在52个CcWD40基因的启动子中检测到防御和胁迫响应元件（TC-rich repeats），在44个CcWD40基因的启动子中检测到低温响应元件（LTR），在95个CcWD40基因的启动子中检测到缺氧诱导（ARE），在53个CcWD40基因的启动子中检测到干旱诱导相关的MYB结合位点（MBS），在1个CcWD40基因的启动子中检测到伤害响应元件（WUN Motif）。在这些与胁迫相关的顺式作用元件中，MBS响应元件的频率最高（在116个CcWD40启动子中共检测到53个MBS响应元件），其次是MYB、TC-rich repeats、LTR和WUN Motif。在CcWD40启动子中发现了与激素相关的各种顺式元件。脱落酸响应元件（ABRE）被发现存在于80个CcWD40启动子上。74个CcWD40启动子含有与MeJA相关的响应元件（CGTCA Motif和TGACG Motif），在116个CcWD40启动子中共有74个MeJA响应元件。此外，在60个CcWD40启动子中发现了生长素响应元件（AuxRE、AuxRR-core、TGA-box和TGA-element），在45个CcWD40启动子中发现了水杨酸反应元件（TCA-element），在20个CcWD40启动子中发现了赤霉素响应元件（GARE Motif）。

通過上述结果推测，CcWD40在参与众多生理反应，并在非生物胁迫反应中起着重要作用。

2.7 CcWD40家族基因响应MeJA的表达分析

MeJA是植物次生代谢产物生物合成中重要信号诱导因子。为了探究可能调控木豆黄酮类物质的潜在CcWD40基因家族成员，通过RNA-seq数据分析CcWD40基因家族116个成员对MeJA的响应模式。结果显示（图6），CcWD40-14、CcWD40-15、CcWD40-16、CcWD40-17之间或CcWD40-18、CcWD40-19、CcWD40-20、CcWD40-21、CcWD40-22、CcWD40-23之间对MeJA激素处理的响应趋势较为相似，而每一组基因在进化树上的分类较为接近。由此可见对于进化关系相近的基因，对MeJA的响应趋势也较为相近。

从整体看，对MeJA响应趋势大体分为两类，其中有96个CcWD40基因在前3个小时对MeJA的响应效果逐渐下降，其余20个会逐渐升高。在前一类CcWD40基因中，有16个基因呈现一直下降的趋势，如CcWD40-52～CcWD40-55等；有47个CcWD40基因在之后的几小时里转变为了上升趋势，如CcWD40-26～CcWD40-30等；有33个CcWD40基因在之后几个小时里转为为上升趋势后，又再次下降，如CcWD40-104～CcWD40-106等。在前3个小时里会逐渐升高的20个CcWD40基因中，有5个基因会在之后一直保持上升趋势，如CcWD40-103等；有14个CcWD40基因会在之后的几个小时里转变为下降趋势，如CcWD40-107等；有1个CcWD40基因在之后转变为下降趋势后重新升高，如CcWD40-11。

3 讨论与结论

3.1 讨论

本研究共鉴定木豆116个WD40基因，与红花（Flos carthami）（40个）、黑果枸杞（Lycium ruthenicum）（38个）、蓖麻（Ricinus communis）（182个）、桃（Prunus persica）（219个）等物种中鉴定的WD40基因数差异较大，这可能是由于木豆属于豆科植物，而红花、黑果枸杞、蓖麻、桃分别属于菊科、茄科、大戟科和蔷薇科，与上述植物亲缘关系上距离较远，特定的生长环境、次生代谢物和不同的形态特征都显示木豆和这些植物在进化上发生了较大差异，而这些蛋白随着植物的长期进化也发生了不同程度的改变，暗示木豆和大豆两种植物具有类似的次生代谢物，而这些相关性以及这些植物是否还存在其他相近的功能还需要进一步的实验探索。

本文分析结果发现木豆CcWD40蛋白的氨基酸数量、等电点等特性均存在差异，这与在许多植物中鉴定到的WD40蛋白一样，例如黄堇（Corydalis pallida）、红花（Flos carthami）等的WD40蛋白特性也存在差异。由于WD40蛋白的功能涉及生长发育、次生代谢物积累和环境适应等多种生物学过程，且参与不同生物学过程可能相互作用的蛋白也不尽相同，因此，木豆不同WD40蛋白可能是为执行不同的生物学功能进化形成的。

染色体定位揭示了CcWD40基因在木豆各染色体上的位置及数量分布。基因结构分析表明CcWD40基因家族中各基因的差异显著，但是根据进化树分成的每个亚组中的基因相似度却很大。启动子响应元件分析可以初步了解特定基因对许多因素的响应，是研究植物基因功能的主要手段之一。木豆CcWD40基因的启动子顺式作用元件分析表明，木豆CcWD40基因家族响应多种激素信号，推测其会参与多种生理反应和非生物胁迫反应。

据相关类似报道，存在于细胞核和细胞质中的丹参WD40蛋白会对MeJA响应元件产生反应［18］。因此推测木豆CcWD40基因的表达也会对茉莉酸甲酯处理有所响应。根据其对MeJA的表达模式分析，木豆CcWD40基因具有响应MeJA处理的表达模式，这些结果清晰地显示CcWD40基因显著响应MeJA，推测可能与CcWD40启动子顺式作用元件中具有多个MeJA响应元件密不可分。而这些基因的功能验证还需要通过实验进一步研究。

3.2 结论

本研究系统鉴定和全面分析了CcWD40基因家族特征，多数CcWD40基因具有MeJA响应元件，基因表达显著受到MeJA的调控。本研究为深入探讨MeJA介导WD40参与黄酮的生物合成提供基础数据，为未来的研究，如功能研究，调控机制研究等提供理论基础。

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