UPF3B促进上消化道恶性肿瘤细胞增殖

侯卜文 舒敏 刘程豪 杜云峰 黎广 姜慧娇 吴向未

摘要：目的 探讨UPF3B对上消化道恶性肿瘤细胞增殖的影响。方法 通过qRT-PCR和Western Blot技术验证胃癌和食管癌细胞中UPF3B的敲低和过表达效率；CCK-8、EdU、平板克隆形成实验评估细胞的增殖能力。结果 在胃癌和食管癌细胞中通过siRNA敲低UPF3B的表达水平，UPF3B的mRNA和蛋白表达水平显著降低，且有统计学意义（P<0.001），CCK8、EdU、平板克隆形成实验结果表明敲低UPF3B抑制胃癌和食管癌细胞的增殖；在胃癌和食管癌细胞中转染UPF3B过表达质粒上调UPF3B的表达水平，UPF3B的mRNA和蛋白表达水平显著升高，且有统计学意义（P<0.001），CCK8、EdU、平板克隆形成实验结果表明过表达UPF3B促进胃癌和食管癌细胞的增殖。结论 UPF3B促进上消化道恶性肿瘤细胞增殖。

关键词：上消化道恶性肿瘤；食管癌；胃癌；UPF3B；增殖

中图分类号：中图分类号R735.7文献标志码：A文献标识码

UPF3B promotes proliferation of malignant tumor cells in upper gastrointestinal tract

HOU  Bowen1，SHU  Min1，LIU  Chenghao1，DU  Yunfeng1，LI  Guang1，JIANG  Huijiao1，WU  Xiangwei1，2*

（1 School of Medicine， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China; 2 The First Affiliated Hospital/

Central Asia Key Laboratory for High Incidence Prevention and Control， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China）

Abstract： Objective To investigate the effect of UPF3B on the proliferation of malignant cells inUpper gastrointestinal malignant tract. Methods Interference and overexpression efficiency of UPF3B in gastric and esophageal cancer cells verified by qRT-PCR and Western blot; the proliferation ability of cells was detected by CCK-8， EdU， and plate colony formation assay. Results siRNA knockdown of UPF3B expression levels in gastric and esophageal cancer cells significantly decreased the mRNA and protein expression levels of UPF3B， and was statistically significant （P<0.001）， and CCK8， EdU and plate colony formation assay showed that knockdown of UPF3B inhibited the proliferation of gastric and esophageal cancer cells; transfection of UPF3B overexpression plasmid in gastric and esophageal cancer cells up-regulated the expression levels of UPF3B， and the mRNA and protein expression levels of UPF3B were significantly increased， and was statistically significant （P<0.001）， and the results of CCK8， EdU and plate colony formation assay showed that overexpression of UPF3B promoted the proliferation of gastric and esophageal cancer cells. Conclusion UPF3B promotes the proliferation of malignant tumor cells in upper gastrointestinal tract.

Key words： Upper gastrointestinal malignant tract;Esophageal cancer;Gastric cancer;UPF3B;proliferation

0 前言

消化道惡性肿瘤是指发生于胃肠道及相关器官的一组异质性癌症，其中上消化道恶性肿瘤主要包括食管癌和胃癌，是十大最常见癌症和癌症相关死亡原因之一。据统计，2020年上消化道恶性肿瘤（胃癌和食管癌）新增大约140万病例，有约130万死亡病例。中国上消化道恶性肿瘤发生率仅次于肺癌， 为恶性肿瘤发病和死亡的主要病因［1］。

RNA结合蛋白（RNA binding protein，RBPs）是一类与转录本和非编码 RNA相互作用的多样化蛋白，通过其自身单个或多个RNA结合域与RNA结合，改变结合RNA的功能，调节生物体的许多细胞过程，创建复杂的动态多水平网络控制核苷酸代谢和基因表达［2-3］。RNA结合蛋白在RNA调控方面发挥重要作用，包括转录、翻译、剪接、多聚腺苷酸化、稳定性和定位［4-10］。RNA结合蛋白还可以通过与其它蛋白的直接相互作用或作为带有编码或非编码RNA的支架，形成核糖核蛋白复合体。目前人类中有大约1 500种经过实验验证的RNA结合蛋白，约占编码基因的7%［11］，其功能失调与多种人类疾病有关，包括肌肉萎缩、神经系统疾病和癌症［4，12］，也因此成为多种癌症潜在的生物标志物和治疗靶点。

先前的研究发现，Up-Frameshift Suppressor 3 Homolog B（UPF3B）是NMD通路中的核心接頭蛋白，可直接与释放因子相互作用，并作为 NMD放大器，使翻译终止。UPF3B还可以直接与核糖体相互作用，并参与NMD途径中mRNA的出核运输和质量监督过程［13］。无义介导的mRNA降解途径（Nonsense mediated decay，NMD）是一种保守的RNA降解途径，能够识别并降解携带有提前终止密码子的异常mRNA，从而确保基因的准确表达。NMD通过下调抑癌基因的表达在肿瘤进展过程中发挥作用［14］。还有研究使用TCGA泛癌数据分析了33种癌症相对于对应正常组织中UPF3B的表达，结果表明UPF3B在多种癌症中呈高表达，且可作为基因预后模型因子，预测各种类型肿瘤的进展，包括肝癌、食管癌、胃癌、肾嫌色细胞癌、皮肤黑色素瘤等。在多种癌症类型中，UPF3B基因的功能主要与泛素介导的蛋白水解、细胞周期和mRNA监视途径有关，且其高表达与预后差显著相关［15-17］。目前UPF3B在食管癌和胃癌中的作用尚未被研究。

1 材料与方法

1.1 细胞培养与主要试剂

人胃癌细胞株SGC-7901和人食管癌细胞株KYSE450购自中国科学院细胞库。SGC-7901和KYSE450常规培养在1%青霉素-链霉素和含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，放置于5% CO2、37 ℃培养箱中孵育。主要试剂详见表1。

1.2 细胞转染siRNA和过表达质粒

siRNA和过表达质粒均由上海吉玛基因设计并构建合成，siRNA序列详见表2。

将细胞SGC-7901和KYSE450分别铺于12孔板中，确保每孔中含有1.2×105个细胞接种在1 mL无双抗且含血清的完全培养基内，转染时细胞汇合度达到60%～70%。使用LipofectamineRNAiMAX转染siRNA，转染24 h后进行后续实验；使用Lipofectamine 3000转染过表达UPF3B及其相应对照的质粒，转染24 h后进行后续实验。

1.3 RNA提取和实时荧光定量PCR

使用E.N.Z.A. Total RNA Kit I从转染24 h的细胞中分离出总RNA，使用NanoDrop 2000分光光度计精确测定提取的RNA浓度。通过逆转录合成cDNA，利用qRT-PCR进行大量扩增。本实验以 β-actin为内参，每组设置3个复孔。应用2-△△CT法分析实验组和对照组的表达差异倍数。引物序列见表3。

引物稀释：（1）10000 g，4 ℃离心2 min，按说明书配比加入相对应量的ddH2O用来溶解引物，涡旋振荡混匀；按所需使用量分装引物至无酶EP管中，放置于-20 ℃冰箱中保存；（2）使用时需将引物用无酶水稀释10倍，即每10 μL的（1）溶液中加入90 μL的无酶水，若长期保存需置于-20 ℃冰箱中保存。

1.4 Western blot实验

分别提取转染siRNA和过表达质粒后48 h后的细胞蛋白。向1 mL预冷的Lysis Buffer加入5 μL磷酸酶抑制剂、1 μL蛋白酶抑制剂和10 μL PMSF。将配制好的预冷的Lysis Buffer加入到12孔板中，每孔100 μL。用SDS PAGE胶分离蛋白，80 V 3 h。转膜条件设置为80 V 60 min。在常温下配置5%的封闭液，封闭120 min。按照一抗：GAPDH稀释比1∶1 000，UPF3B稀释比1∶2 000。于4 ℃冰箱过夜，第二天清洗一抗，在常温条件下孵育二抗（稀释比为1∶5 000），2.5 h，最后使用1×TBST洗3次（每次10 min）后进行曝光并检测蛋白质。

1.5 Cell Counting Kit-8（CCK）实验

CCK-8增殖实验检测分别转染siRNA和过表达质粒后的细胞的增殖能力。将约2 000个细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后（约6 h），在不同时间点每孔加入10 μL CCK-8溶液，放于培37 ℃养箱中进行2 h的孵育。测定450 nm处吸光度，每孔检测3次并进行记录。使用GraphPad Prism进行数据统计和分析。

1.6 EdU实验

将细胞SGC-7901和KYSE450分别铺于12孔板，经过24 h的转染处理，向每孔内加入1 mL EdU储存液，标记细胞2 h，并用含3% BSA的PBS洗涤3次；每孔中加入1 mL 3.7%甲醛固定细胞15 min，并用含3% BSA的PBS洗涤3次；每孔加入1 mL 0.5% TritonX-100通透液，室温孵育20 min，含3% BSA的PBS洗涤3次；每孔加入500 μL EdU Click反应液，室温避光孵育30 min，含3% BSA的PBS洗涤3次；每孔中加入细胞核染色液，室温避光孵育30 min，PBS 洗涤3次，最终每个孔保留1 mL的PBS，立刻进行荧光显微镜下观察拍照。使用GraphPad Prism将得到的结果进行数据统计和分析。

1.7 平板克隆实验

将细胞SGC-7901和KYSE450分别铺于12孔板，转染处理24 h后，根据实验分组分别取2 000个细胞铺于6孔板中，并轻轻晃动，使细胞均匀分布于孔板中。在37 ℃，5％CO2条件下的孵箱中培养2～3周，每组设置3个孔。期间根据培养液及细胞状态情况，更换完全培养基。当六孔板中出现肉眼可见的克隆时，应立即终止培养。将上清液弃去，使用PBS轻柔清洗2次。每孔加入4%多聚甲醛600 μL，并将其放置于4 ℃冰箱中固定细胞20 min。弃固定液，加入1%结晶紫染色液600 μL，在室温下染色30分钟，用流水缓慢将染色液洗去。将六孔板倒扣在吸水纸上，待自然风干后拍照记录，使用ImageJ软件对细胞数超过50个的集落进行计数。使用GraphPad Prism进行数据统计和分析。

1.8 医学统计方法

本实验涉及的数据均为3次独立实验结果，使用Graphpad Prism 8.0进行数据分析及统计，结果符合正態分布的以均数±标准差（±S）的格式表示，不满足正态分布的结果用中位数和四分位间距表示。使用unpaired two-tailed Student′s t-test统计学方法进行实验组和对照组之间的统计分析。P＜0.05表示差异具有统计学意义，用*表示；若P＜0.01，用**表示；若P＜0.001，用***表示。使用Graphpad Prism 8.0软件作图。

2 结果

2.1 胃癌和食管癌细胞中UPF3B的干扰和过表达情况

将针对UPF3B的siRNA，对SGC-7901和KYSE450细胞进行体外干扰UPF3B表达，且通过qRT-PCR和WB技术检测UPF3B的敲低效率。实验结果显示对于SGC-7901和KYSE450细胞，3种不同序列的siUPF3B均能显著下调UPF3B的转录和蛋白水平（图1A、1B）。同样对SGC-7901和KYSE450细胞体外转染含UPF3B的质粒载体上调UPF3B表达量，将空的pEX-4载体作为空白对照。通过qRT-PCR和WB技术检测UPF3B发现，与空白对照组相比，转染含UPF3B的质粒载体均能显著上调UPF3B的转录和蛋白水平（图1C、1D）。

A.qRT-PCR分析证实siRNA在SGC-7901和KYSE450细胞中下调UPF3B mRNA水平;B.WB分析证实siRNA在SGC-7901和KYSE450细胞中下调UPF3B蛋白水平;C.qRT-PCR分析证实过表达质粒在SGC-7901和KYSE450细胞中上调UPF3B mRNA水平;D.WB分析证实过表达质粒在SGC-7901和KYSE450细胞中上调UPF3B蛋白水平。差异的显著性由unpaired two-tailed Student′s t-test确定。* P＜0.05；** P＜0.01；*** P＜0.001。

2.2 CCK8实验分析UPF3B干扰和过表达后细胞的增殖情况

转染siRNA至SGC-7901和KYSE450细胞72 h后进行CCK8实验检测发现，转染siUPF3B组的OD值与对照组相比均明显降低且具有统计学意义（图2A、2B）。转染质粒载体于SGC-7901和KYSE450细胞72 h后进行CCK8实验结果发现，转染过表达质粒组的OD值与对照组相比明显降低且具有统计学意义（图2C、2D）。CCK8实验表明下调UPF3B后，细胞的增殖能力减弱；UPF3B过表达后其增殖能力显著增强。CCK8实验证明在食管癌和胃癌细胞中，UPF3B可促进其增殖。

A.敲低UPF3B抑制SGC-7901和KYSE450细胞增殖能力。B.过表达UPF3B促进SGC-7901和KYSE450细胞增殖能力。差异的显著性由unpaired two-tailed Student′s t-test确定。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。图2 CCK8实验：UPF3B促进胃癌和食管癌细胞的增殖

2.3 EdU实验分析UPF3B干扰和过表达后细胞的增殖情况

SGC-7901和KYSE450细胞下调UPF3B后，EdU-掺入细胞的比例明显下降（图3A）；过表达UPF3B后，EdU-掺入细胞的比例显著上升（图3B）。EdU实验结果表明下调UPF3B后，细胞的增殖能力减弱；过表达UPF3B后，增强了这2种细胞的增殖能力。EdU实验再次验证，在食管癌和胃癌细胞中，UPF3B均可促进其增殖。

2.4 平板克隆实验分析UPF3B干扰和过表达后细胞的增殖情况

转染siRNA下调UPF3B后，SGC-7901和KYSE450细胞克隆形成团数较对照组显著减少（图4A）。转染含UPF3B的质粒载体上调UPF3B表达量后，其克隆形成团数较对照组显著增多且具有统计学意义（图4B）。克隆形成实验结果显示，下调UPF3B后，细胞的增殖能力会减弱；当过表达UPF3B后，细胞的增殖能力会增强。

A.SGC-7901和KYSE450细胞下调UPF3B后，掺入EdU的代表性荧光照片（左）和量化图（右）；B.SGC-7901和KYSE450细胞过表达UPF3B后，掺入EdU的代表性荧光照片（左）和量化图（右）。

差异的显著性由unpaired two-tailed Student′s t-test确定。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。图3 EdU实验：UPF3B促进胃癌和食管癌细胞的增殖

A.敲低UPF3B抑制SGC-7901和KYSE450细胞集落形成能力；B.过表达UPF3B促进SGC-7901和KYSE450细胞集落形成能力。差异的显著性由unpaired two-tailed Student′s t-test确定。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001。图4 平板克隆实验：UPF3B促进胃癌和食管癌细胞的增殖

3 讨论

近年来，随着早期诊断和治疗技术的飞跃提升，许多患者的生存情况得到改善，但上消化道恶性肿瘤仍保持极高的发病率和致死率。据2020年全球癌症统计数据报告显示，目前上消化道恶性肿瘤仍然是全球高度难治性且高发性恶性肿瘤之一，每年约有140万新增病例和130万例死亡病例［1］。细胞稳态失调导致细胞生长和增殖失控是肿瘤典型特征之一，但其中复杂的调控网络尚未完全明了。

越来越多的报道称UPF3B可作为候选RNA结合蛋白基因预测各种类型肿瘤的进展，包括肝癌、食管癌、肾嫌色细胞癌、皮肤黑色素瘤［15］。有文献报道UPF3B参与无义介导的mRNA降解途径（NMD），且作为该途径中的核心接头蛋白，参与mRNA的出核运输和质量监督［13］。NMD通路是一种重要的RNA监视机制，能识别和降解含有提前终止密码子的异常mRNA，以确保基因的准确表达［14］。癌症中突变的肿瘤抑制基因可以通过NMD降解，因此通常认为此途径参与肿瘤的发生［18-19］。既往研究表明UPF3B突变可引起多种精神疾病，如智力残疾和精神分裂症。UPF3B 是多蛋白复合物的一部分，参与mRNA核输出和无感觉介导的NMD途径的启动。约11%的人类遗传病是由于NMD途径的改变。UPF3B已被确定为NMD诱导疾病（包括癌症）的潜在治疗方法［12］。有研究通过综合分析癌症基因组图谱 （TCGA），开发出一种 DNA 修复相关基因标志物，其中包括UPF3B，来预测食管癌患者的预后［13］。目前UPF3B在上消化道肿瘤中还未得到研究。

本研究選择上消化道肿瘤中主要的癌症类型即胃癌和食管癌，进行体外验证UPF3B对胃癌和食管癌细胞系的生物学功能影响。通过CCK8、EdU和平板克隆形成实验验证siRNA敲低UPF3B后两种癌细胞的增殖能力受到显著抑制，而质粒过表达UPF3B后增殖能力明显增强。

综上所述，本研究发现UPF3B促进上消化道恶性肿瘤细胞增殖，提示UPF3B可能参与了上消化道恶性肿瘤的发生发展，但其作为RNA结合蛋白影响上消化道恶性肿瘤的作用机制需要进一步的分析和实验验证。肿瘤细胞的侵袭和迁移也是其恶性表型的重要特征，UPF3B对上消化道肿瘤细胞侵袭和迁移的影响还需要进一步实验验证，为更全面的了解其促癌作用提供实验依据。

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（責任编辑：编辑唐慧）