miR-181a靶向Bcl-2调控氧糖剥夺/再灌注模型诱导的 SH-SY5Y神经细胞凋亡

袁珊 杨玉莹 许梅梅 胡广泽 高蕊

摘要： 目的 皮層是响应脑缺血缺氧最为敏感的组织之一，基于前期深度测序技术，我们筛选获得响应脑缺血缺氧应激的皮层区目标基因miR-181a及Bcl-2。本研究旨在SH-SY5Y细胞株氧糖剥夺/复糖复氧模型验证二者靶向调控关系及功能，明确miR-181a—Bcl-2调控网络在OGD/R诱导的神经细胞凋亡中的作用。方法 采用线栓法构建大鼠缺血缺氧再灌注损伤模型，脑切片TTC染色及行为学评分法评估模型。应用qRT-PCR及Western Blot验证目标基因的表达。生物信息学分析miR-181a与Bcl-2的靶向结合位点并比对结合位点的保守性，双荧光素酶报告基因实验验证miR-181a与Bcl-2靶向结合的特异性。采用OGD/R细胞模型体外模拟脑缺血再灌注损伤，检测凋亡相关蛋白表达及Hoechst荧光染色评估细胞凋亡。结果 大鼠大脑中动脉阻塞后miR-181a、Bcl-2表达变化趋势相反。RNA hybird软件预测miR-181a可结合Bcl-2的3′-UTR区，且结合区域高度保守。双荧光素酶报告基因实验发现，相对于Bcl-2 3′UTR-WT与mimic-NC共转染组，Bcl-2 3′UTR-WT与miR-181a mimic共转染后的荧光活性更低（P＜0.001），而Bcl-2-Mut与miR-181a mimic共转染组，荧光活性无显著差异（P＞0.05）。分别用miR-181a的模拟物及抑制物转染OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞，miR-181a可以抑制Bcl-2 mRNA及其蛋白的表达水平（P＜0.001）。过表达 miR-181a显著增加了SH-SY5Y细胞的凋亡（P＜0.001），而抑制 miR-181a 表达可使 SH-SY5Y细胞凋亡显著降低（P＜0.001）。结论 miR-181a 可靶向结合Bcl-2，下调miR-181a可通过促进Bcl-2的表达进而抑制SH-SY5Y神经细胞OGD/R损伤诱导的细胞凋亡。

关键词：miR-181a；Bcl-2；SH-SY5Y；OGD/R；凋亡

中图分类号： R34文献标志码：A文献标识码

MiR-181a regulates the apoptosis of SH-SY5Y cells induced by OGD/R model by targeting Bcl-2

YUAN  Shan，YANG  Yuying，XU  Meimei，HU  Guangze，GAO  Rui*

（Department of Biochemistry， School of Medicine/The Key Laboratory of Ministry of Education for Xinjiang Endemic & Ethnic Disease， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000， China）

Abstract：  Objective

The cortex is one of the most sensitive tissues in response to cerebral hypoxia-ischemia. Based on the previous deep sequencing technology， we screened and obtained cortical target genes miR-181a and Bcl-2 that closely respond to cerebral hypoxia ischemia stress. The aim of this study is to verify the above targeted relationships and functions in SH-SY5Y cell line induced by the oxygen-glucose deprivation/reperfusion （OGD/R）， and to clarify the role of miR-181a-Bcl-2 regulatory network in OGD/R induced nerve cell apoptosis. Methods The model of hypoxic-ischemic and reperfusion injury in rats was established by suture method， and the model was evaluated by TTC staining and behavioral score. Target gene expression was verified by qRT-PCR and Western Blot. Bioinformatics was used to analyze the target binding sites of miR-181a and Bcl-2 and compare the conservation of the binding sites. The specificity of targeted binding between miR-181a and Bcl-2 was confirmed through dual-luciferase reporter gene experiments. The OGD/R model was used to simulate cerebral ischemia-reperfusion injury in vitro. Cell apoptosis was detected by apoptosis-related protein expression and Hoechst fluorescence staining. Results The expression of miR-181a and Bcl-2 was reversed after middle cerebral artery occlusion in rats. RNA hybird software predicted that miR-181a could bind to the 3′-UTR region of Bcl-2 mRNA， and the nucleotides in the binding region were highly conserved. Dual luciferase reporter gene assay showed that compared with the Bcl-2 3′UTR-WT and mimic-NC co-transfection group， the fluorescence activity of Bcl-2 3′-UTR and miR-181a mimic co-transfection group was lower （P<0.001）. There was no significant difference in the fluorescence activity of Bcl-2-Mut co-transfected with miR-181a mimic group （P>0.05）. After the OGD/R model was constructed， SH-SY5Y cells were transfected with miR-181a mimics and inhibitors， respectively. It was found that miR-181a could inhibit the expression levels of Bcl-2 mRNA and protein （P<0.001）. Overexpression of miR-181a significantly increased the apoptosis of SH-SY5Y cells （P<0.001）， while inhibition of miR-181a expression significantly decreased the apoptosis of SH-SY5Y cells （P<0.001）. Conclusion miR-181a can target Bcl-2 and down-regulation of miR-181a can inhibit the OGD/R injury induced apoptosis of SH-SY5Y nerve cells by up-regulating the expression of Bcl-2.

Key words： miR-181a;Bcl-2;SH-SY5Y;OGD/R;apoptosis

0 前言

脑卒中通常分为两大类：缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中缺血性脑卒中病例占所有脑卒中病例的87%，它是全球第二大死亡原因，同时也是导致严重残疾的主要因素［1］。与细胞主要通过坏死死亡的缺血核心不同，细胞凋亡在半影区普遍存在［2-3］卒中缺血核心区神经细胞迅速坏死，而半影区受损细胞普遍发生凋亡［2-3］，半暗带中较弱的损伤主要引起细胞凋亡［4-5］。神经细胞特别是神经元对缺血缺氧刺激敏感且再生能力有限，挽救这类处于可逆状态的神经细胞凋亡进程是目前主要的干预方法，因此深入了解缺血性卒中脑损伤的潜在分子及调控机制迫在眉睫。

微小 RNA（microRNA，miRNA）是一类不具有编码能力的单链RNA［6］，一般长度为21～25 nt，它在多种生物体内广泛分布。miRNA 在不同生物中高度保守，且在组织中具有高度的特异性［7］。研究表明，miRNA主要是在转录后水平调控基因表达［8-10］，即负向调控mRNA的翻译，在疾病发生发展的进程中调节靶基因的蛋白表达水平。近年来，miRNA在神经系统的作用开始被学者所认识，且被证实miRNA在急性缺血性脑卒中等神经系统疾病中发挥着重要的调控作用。例如，miR-26a可以激活AKT和ERK信号通路上调HIF-1α的表达，并通过调控VEGF转录活性，促进MCAO模型中血管的生成［11］；miR-190在I/R大鼠中表达显著降低，而过表达miR-190后下调Rho/Rho激酶mRNA和蛋白表达，同时降低了细胞的凋亡率［12］。Bcl-2基因（B细胞淋巴瘤/白血病-2基因B-cell lymphoma 2， Bcl-2）是一种癌基因，亦是最重要的抗细胞凋亡基因，常作为内源性神经保护物质，当Bcl-2表达量升高时，能发挥抑制缺血所致的神经元凋亡的功能［13］，因此它在腦缺血再灌注损伤中发挥了重要保护作用。

目前已有文献报道miR-181a通过靶向Bcl-2在疾病中发挥重要作用，例如miR-181a通过靶向Bcl-2在低侵袭性乳腺癌细胞中对阿霉素化疗敏感性的功能作用［14］；miR-181a通过靶向Bcl-2使人恶性胶质瘤U87MG细胞对辐射敏感［15］；miR-181a通过靶向Bcl-2使多重耐药白血病细胞系K562/A02对柔红霉素敏感［16］。此外，miR-181a在细胞凋亡中发挥的调控作用也有文献报道，例如miR-181a通过诱导细胞凋亡使耐药白血病HL-60/Ara-C细胞对Ara-C敏感［17］；miR-181a有助于蟾蜍灵诱导PC-3前列腺癌细胞凋亡［18］。但是在OGD/R诱导神经细胞损伤模型中是否存在miR-181a与Bcl-2的靶向关系，以及miR-181a—Bcl-2轴在OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞凋亡中发挥的功能仍需进一步探究。

本研究旨在体外实验验证miR-181a与Bcl-2的调控关系，并探讨miR-181a—Bcl-2轴对OGD/R模型诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响，为miR-181a调控脑缺血再灌注神经细胞凋亡的机制提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

本研究使用的SH-SY5Y细胞株（人神经母细胞瘤细胞）购自武汉大学生命科学学院中国典型培养物保藏中心（细胞库）。293T细胞（人肾上皮细胞）由石河子大学医学院生化教研室提供。miR-181a模拟物及其阴性对照（miR-181amimic/mimic-NC）、miR-181a抑制物及其阴性对照（miR-181ainhibitor/inhibitor-NC）、Bcl-2 3′UTR野生型和突变型质粒购自上海吉玛制药技术有限公司。LipofectamineTM 3000试剂购自ThermoFisher公司。

1.2 方法

1.2.1 MCAO模型构建

大鼠用戊巴比妥钠（40mg·kg-1）麻醉并固定在仰卧位。常规皮肤消毒和准备后，在颈部中线左侧做一个小切口（～25mm），钝性分离颈动脉肌肉，暴露颈内动脉、颈外动脉以及颈动脉分叉处。在颈外动脉切开一个小切口，将硅胶涂层的MCAO栓塞（中国广东广州嘉灵生物科技有限公司）小心地经颈内动脉插入大脑中动脉，直至出现轻微阻力。栓塞2小时后，移除栓子以进行再灌注。假手术组手术操作与MCAO组相同，只是不进行栓塞处理。

1.2.2 神经行为学评分

MCAO模型大鼠撤栓血液再灌注24 h之后开始评分，联合采用longa评分标准进行评分，以最大程度保证模型的有效性（表1）。所有评分操作均由对实验不知情的研究人员进行，以避免主观因素对结果的影响。

1.2.3 TTC染色及梗死密度扫描

在冰上将大鼠鼠脑取出后，立即将鼠脑放于干净培养皿中于-20℃冰箱下冷冻20 min固形，将组织连续切成2 mm厚的冠状切片，在2%的TTC染色溶液中37℃培养箱内避光孵育，每隔5 min将切片翻面，注意需染色均匀。15～20 min后取出脑片，使用4%多聚甲醛固定液固定，观察并拍照，应用Image J图像分析软件扫描梗死密度，并计算梗死密度百分比。

1.2.4 miR-181a 与 Bcl-2 基因 3′-UTR 区结合位点预测及保守性分析

使用 miRanda 和 targetscan 进行 miR-181a 的靶基因预测，发现 Bcl-2 为其靶基因，通过 RNA hybird 软件预测 miR-181a 成熟体序列与 Bcl-2 基因的 3′ -UTR 区存在保守的结合位点。在 miRBase 数据库（http：//www.mirbase. org/）下载人、大鼠、小鼠、大猩猩、猕猴、豚尾猕猴、原鸡、斑马鱼、绵羊和鸭嘴兽等10个物种的 miR-181a 成熟序列进行保守性分析。

1.2.5 双荧光素酶报告基因实验

使用 293T 细胞用于双荧光素酶报告基因系统检测，按照 Lipofectamine 3000 试剂说明书，将 miR-181amimic、mimic NC 分别与 Bcl-2 3′UTR-WT、Bcl-2 3′UTR-Mut 两两进行共转染，每个处理设置3孔重复。将转染的细胞置于37 ℃共培养24 h后，使用  Dual-Luciferase 报告基因检测系统试剂盒检测细胞荧光素酶活性。以萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶的比值作为相对荧光活性。

1.2.6 细胞培养与转染

将 SH-SY5Y 细胞复苏24 h后观察细胞状态，并根据细胞生长情况更换培养基。用PBS 清洗2遍 SH-SY5Y 细胞，加入 2 mL 胰蛋白酶消化。在显微镜下观察到细胞呈现流沙状时，立即加入 4 mL 完全培养基终止消化。在 800 r·min-1条件下离心5 min，弃上清液后加入 1 mL 完全培养基重悬 SH-SY5Y细胞，并将其接种至 10 cm 细胞培养皿，在37 ℃，5% CO2环境下培养；293T 细胞的操作步骤与之相同。在6孔板中根据试剂盒说明书进行，使用 Lipofectamine 3000 转染miR-181a的mimic和inhibitor，并在转染后24 h收取细胞待检。

1.2.7 OGD/R 模型的构建

将 SH-SY5Y 细胞培养至状态良好后按照接种量进行细胞铺板，等到第二天细胞生长至所需状态及数量后（16～24 h），用1×无菌PBS清洗3次，之后将皿内10%完全培养基置换成无糖DMEM培养基。将神经细胞置于预先充95% N2、0% O2、5% CO2混合气的三气培养箱中，进行缺糖缺氧处理。OGD处理结束后，弃去无糖DMEM培养基，加入10%完全培养基，然后将细胞置于5% CO2的常氧培养箱继续培养，在复糖复氧24 h后，收集细胞用于后续实验研究。

1.2.8 qRT-PCR 檢测

茎环引物及 PCR 引物信息见表2。qRT-PCR 使用 TB Green Premix Ex TaqTM 试剂盒（RR800A， Takara， Japan），采用15 μL体系，PCR 体系及反应条件见表3、表4。

1.2.9 Western Blot检测

将脑组织在液氮中捣碎，在冰上用 RIPA 缓冲液裂解30 min并进行超声处理（30%能量，2 s持续时间，2 s间隔，总时间30 s）。在4℃下以12 000 r·min-1离心10 min。将上清液转移到新管中。添加 PMSF（10∶1 000），并使用 BCA 试剂盒（Biomiga）测定蛋白质浓度。对于 SH-SY5Y 细胞，用 PBS 洗涤细胞，在冰上用 RIPA 缓冲液裂解30 min并进行超声处理（30%能量，2 s持续时间，2 s间隔，总时间30 s）。添加 PMSF（10∶1 000），并使用BCA试剂盒（Biomiga）测定蛋白质浓度。蛋白质 （30 μg） 通过10% SDS-PAGE 分离并转移到NC膜上。将膜封闭2 h（室温下5% BSA）。将膜与抗Bcl-2（abcam，ab196495，1∶1 000）、Bax（abcam，ab53154，1∶2 000）、β-actin（中杉金桥，TA-09，1∶2 000）在 4 ℃ 过夜。将膜用TBS-Tween-20（TBS-T）洗涤3次，并与二抗在室温下孵育2 h。将膜用TBS-T洗涤3次，并在 West Femto ECL Substrate（Beijing Solarbio Science & Technology Co.， Ltd.）下暴露于 Bio-Rad ChemiDoc XRS（Bio-Rad Laboratories， Inc.），并用 ImageJ（v. 1.6.0）进行分析。

1.2.10 Hoechst 荧光染色

OGD/R 模型结束后，每孔加入适当量 Hoechst 33258 染色液充分覆盖住待染色的样品（六孔板每孔加入1 mL，96孔板每孔需加入100 μL）。培养箱中放置20～30 min。弃去染色液，用1×PBS 或培养基洗涤2～3次。结果直接在荧光显微镜下观察，拍照记录结果。

1.2.11 统计学方法

所有实验均进行3次重复，用平均值± SD表示，组别比较采用方差分析和独立样本t检验，使用 SPSS 19.0 统计学软件对其进行统计学分析。P<0.05为具有统计学意义。qRT-PCR 采用2 -ΔΔCt方法计算其相对表达水平。

2 结果

2.1 大鼠 MCAO 2 h/R 24 h 模型的构建与评估

由于大脑皮层对脑缺血十分敏感，因此在本研究中，我们选择了皮层区域进行数据挖掘，在 SD 大鼠上构建了 MCAO 模型，腔内线栓阻断法对大鼠大脑中动脉进行梗死2 h、再灌注24 h处理。模型结束后收集 Sham 组与 MCAO 组的大鼠大脑皮层进行高通量测序，测序结果显示缺血缺氧损伤后，miR-181a 表达下调，Bcl-2 表达上调。我们前期发表的成果［19］上传了该数据集，可在国家生物技术信息中心（NCBI）的短读档案 （SRA） 中找到，生物项目编号为 PRJNA690203（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA690203/）。

为了验证 miR-181a 与 Bcl-2 的表达趋势是否与测序结果一致，本研究在 SD 大鼠上构建了 MCAO 2 h/R 24 h 动物模型。在神经行为学上，longa 评分结果显示，MCAO 组大鼠相较于 Sham 组具有明显的神经行为缺损（P<0.05）（图1B）。在病理上，MCAO 组全脑切片 TTC 染色显示梗死区颜色苍白且出现较为严重的水肿，对照组大脑组织颜色红润，无明显梗死病灶（图1A）；对梗死密度进行量化，结果显示MCAO组大鼠的梗死密度显著高于Sham组大鼠（P<0.001）（图1C）。神经行为学与病理切片的结果均表明模型构建成功，可以进行后续实验研究。

2.2 MCAO 模型中 miR-181a、Bcl-2 的表达变化

收集 SD 大鼠大脑皮层组织的总 RNA 和总蛋白，检测 miR-181a、Bcl-2 表达趋势是否与测序结果相一致。结果显示，与 Sham 组相比，miR-181a 的表达在 MCAO 模型损伤后上调（P<0.001）（图2A），Bcl-2 mRNA 及蛋白的表达在 MCAO 模型损伤后均下调（P<0.001），并且 Bcl-2/β-actin蛋白比值显著降低（P<0.001）（图2B～2D）。以上结果显示，miR-181a 与 Bcl-2 的表达变化趋势相反；此外，上述结果还表明在脑缺血再灌注损伤后，伴随 miR-181a 的高表达与Bcl-2的低表达。

2.3 miR-181a 与 Bcl-2 基因 3′-UTR 区结合位点预测及验证

通过 RNA hybird 软件预测 miR-181a 成熟体序列与 Bcl-2 基因的 3′-UTR 区存在保守的结合位点（图3）。miR-181a 成熟序列以及种子区序列“ACAUUC”在人、大鼠、小鼠、大猩猩、猕猴、豚尾猕猴、原鸡、斑马鱼、绵羊和鸭嘴兽等物种之间高度保守（表5）；Bcl-2与 miR-181a 的结合位点“GAAUGUA”在大鼠、小鼠、人、猫、猪、兔等物种之间高度保守，这提示二者可能在多个物种之间发挥类似的生物学功能。根据其保守结合区域，我们构建了含有 miR-181a 和 Bcl-2 3′-UTR 区结合位点附近区域序列的野生型和突变型质粒，进行双荧光素酶报告基因检测二者的结合位点。通过荧光素酶报告基因实验发现，293T 细胞中共转染带有 Bcl-2 3′-UTR 区序列的质粒和miR-181a mimic可以导致荧光素酶活性的下调，而共转染 Bcl-2 突变型质粒和miR-181a mimic后荧光素酶活性无变化。以上结果表明miR-181a 可与 Bcl-2 3′-UTR 结合，即 miR-181a 可以靶向结合 Bcl-2。

2.4 miR-181a 可以负向调控 Bcl-2 mRNA 及蛋白表达

在 SH-SY5Y 细胞 OGD/R 探究 miR-181a 与 Bcl-2 是否具有相反的调控模式，合成了 miR-181a mimic、miR-181a inhibitor 片段及其对应的阴性对照 mimic-NC 和 inhibitor-NC。在培养的 SH-SY5Y 细胞转染上述片段，通过 qRT-PCR 检测其转染效率，以确保本研究所采用的寡核苷酸能够达到实验要求。如图4所示，结果显示 mimic 组的 miR-181a 表达升高约为5 000倍，且 Bcl-2 mRNA 和蛋白表达显著降低；inhibitor 组结果显示 miR-181a 表达降低约为70%，且 Bcl-2 mRNA 和蛋白表达显著升高。以上结果表明 miR-181a 可负向调控 Bcl-2 转录后水平的表达。

2.5 SH-SY5Y细胞构建OGD/R损伤模型

为了探究 miR-181a—Bcl-2 轴在脑缺血缺氧损伤中的生物学功能，我们首先在 SH-SY5Y 细胞上构建了氧糖剥夺/复氧复糖（OGD/R）细胞模型，用以模拟脑缺血再灌注损伤的神经细胞，之后检测缺糖缺氧2、4、6 h后复糖复氧24 h的 SH-SY5Y 细胞的活力与氧化应激水平。CCK-8 细胞活力及台盼蓝拒染的实验结果显示，随着 OGD 处理时间的持续延长，细胞存活率逐渐降低，至 OGD 6 h/R 24 h 细胞存活率降至60%（P<0.01）（图5A、5B）。之后检测 SOD 酶活性及 MDA 含量，结果显示 SH-SY5Y 细胞氧化应激水平随着缺糖缺氧时间的延长逐渐增加，SOD活力显著下降（P<0.01），MDA 含量明显升高（P<0.001）（图5C、5D）。以上结果提示在 SH-SY5Y 细胞成功构建 OGD/R 模型，且随缺糖缺氧时间延长，细胞损伤进一步加重。

2.6 在 SH-SY5Y 细胞 OGD/R 模型损伤时段构建 miR-181a、Bcl-2 的时序表达谱

为了探究 SH-SY5Y 细胞在 OGD/R 损伤后 miR-181a、Bcl-2 的表达变化，我们检测了 SH-SY5Y 细胞缺糖缺氧不同时段、复糖复氧 24 h 后的上述两种 RNA 及靶标蛋白的表达变化。如图6所示，从 OGD 2 h/R 24 h 开始，miR-181a 的表达显著升高（P<0.05），Bcl-2 mRNA 水平及蛋白水平的表达均显著降低（P<0.01），二者的表達趋势相反，且在OGD 6 h/R 24 h损伤时段，miR-181a 和 Bcl-2表达的反向趋势最为显著，因此选择 OGD 6 h/R 24 损伤时段进行后续研究。

2.7 下调 miR-181a 可介导 Bcl-2 上调挽救缺血缺氧损伤诱导的神经细胞凋亡

为了进一步研究下调 miR-181a 是否可通过上调 Bcl-2 基因抑制 SH-SY5Y 神经细胞凋亡，在对 SH-SY5Y 细胞进行 OGD 6 h/R 24 h 处理，之后转染 miR-181a mimic 及 inhibitor，图7结果显示 OGD 6 h/R 24 h 损伤后 miR-181a 表达显著升高（P<0.001），Bcl-2 mRNA 及蛋白表达均显著降低（P<0.001）；与 OGD/R 组相比，OGD/R + miR-181a mimic 组 Bcl-2  mRNA 和蛋白表达显著降低（P<0.001）、OGD/R + miR-181a inhibitor 组 Bcl-2 的 mRNA 和蛋白表达显著升高（P<0.001）。Bcl-2 和 Bax 的比值改变可以反映凋亡的水平，当 Bcl-2/Bax 比值降低表明凋亡水平增加，Bcl-2/Bax 比值升高表明凋亡水平降低。检测各个组别二者比值改变，图7结果显示与 control 组相比，OGD 6 h/R 24 h 组 Bcl-2/Bax 蛋白比值显著降低（P<0.001）。与 OGD/R 组相比，OGD/R + miR-181a mimic 组 Bcl-2/Bax 蛋白比值显著降低（P < 0.001）；OGD/R + miR-181a inhibitor 组Bcl-2/Bax 蛋白比值显著增加（P < 0.001）。以上结果进一步提示 miR-181a 与 Bcl-2 具有相反的调控模式；此外Bcl-2/Bax 蛋白比值变化初步提示 miR-181a inhibitor 可以逆转 OGD/R损伤诱导的细胞凋亡。

为了进一步研究 miR-181a—Bcl-2 轴介导 SH-SY5Y 神经细胞凋亡的影响，通过Hoechst 荧光染色检测 SH-SY5Y 细胞凋亡情况。图8结果显示，与 control 组相比，OGD 6 h/R 24 神经细胞凋亡水平均顯著增加（P<0.001）。与 OGD/R 组相比，OGD/R + miR-181a mimic 组细胞凋亡水平显著增加（P<0.001）；OGD/R + miR-181a inhibitor 组细胞凋亡水平显著降低（P<0.001）。荧光染色结果进一步提示下调miR-181a 可以介导Bcl-2的上调从而逆转OGD/R损伤诱导的神经细胞凋亡。

3 讨论

中风是全球第二大死因，每年约有670万人死于中风［20］，其中缺血性中风占病例的 80% 以上，主要是由于颈内动脉或大脑中动脉突然阻塞所致［21］，而 MCAO 实验模型是最常用的短暂性局灶性脑缺血再灌注损伤动物模型，可用于临床前研究缺血性脑卒中的病理生理学及其潜在机制研究［22］。OGD/R 模型是体外模拟脑缺血再灌注损伤的公认模型，在剥夺相应时段神经细胞中的葡萄糖和氧气后再给予恢复，以此模拟脑缺血再灌损伤中的神经细胞［23-24］。SH-SY5Y 细胞是一种可以分化为具有成熟神经元形态和生物特征的神经细胞［25］，常被用于神经损伤性疾病机制的研究。

在缺血核心区域，许多细胞尤其是神经元，会在仅仅5 min内死亡，而毗邻区域的神经细胞处于可逆状态，因此挽救这类神经细胞是目前研究的主要方向［26］。细胞凋亡是缺血性中风的关键机制，挽救细胞凋亡可减轻缺血和再灌注诱导的脑损伤。

目前已有许多文献证实 microRNA 在缺血性中风诱导的神经细胞凋亡中发挥重要调控作用，例如 miR-124 通过靶向小鼠 DAPK1 减轻缺血性中风诱导的神经元死亡，包括小鼠的整体神经功能［27］；microRNA-195 通过抑制 KLF5 介导的 JNK 信号通路激活来减轻缺血性中风大鼠的神经细胞凋亡［28］；上调 microRNA-9 通过靶向缺血性中风中的 Bcl2l11 抑制神经细胞凋亡［29］。基于此，本研究向 OGD/R 处理的 SH-SY5Y 细胞中分别转染了 miR-181a 模拟物和抑制物以及其阴性对照，发现过表达 miR-181a 能促进缺血缺氧诱导的 SH-SY5Y 细胞凋亡，抑制 miR-181a 的表达，SH-SY5Y 细胞凋亡率明显降低，再次证实了下调 miR-181a 可上调 Bcl-2 从而对脑缺血再灌注损伤诱导的神经细胞凋亡发挥保护作用。

在先前报道中，双荧光素酶报告基因实验证实了 miR-181 可靶向多个 Bcl-2 家族成员（Bcl-2、Mcl-1），其中 miR-181 对 Bcl-2 和 Mcl-1 的调节有助于在体外缺血应激（葡萄糖剥夺）星形胶质细胞中观察到线粒体功能障碍［30］。Bcl-2调控细胞凋亡机制如下［31］：Bcl-2 可竞争性地结合 Bax 蛋白，减少 Bax/Bak 寡聚化在线粒体外膜上形成孔，阻止细胞色素c等促凋亡物质释放入胞质。细胞色素 c 与细胞质中的凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）结合形成凋亡小体，激活 caspase-3 介导凋亡。Mcl-1 在细胞凋亡机制如下［32］：Mcl-1也可以通过在线粒体外膜螯合促凋亡蛋白 Bak 阻止其寡聚化和细胞色素 c 释放来发挥抗凋亡作用。

我们的研究为 OGD/R 诱导的神经细胞凋亡机制提供了新的思路，但本研究仍然存在不足之处：虽然下调的 miR-181a 负向调控靶标 Bcl-2 发挥抑制神经细胞凋亡的作用，但这种作用是否与 miR-181a 通过对其它 Bcl-2 家族成员的表达调控，进而协同发挥抑制神经细胞凋亡的作用还不明确；此外我们仅在细胞水平上进行了验证，miR-181a—Bcl-2 轴在体内是否发挥同样的功能仍需进一步探究；且 miR-181a 在缺血性脑卒中上调的原因以及 miR-181a 上游的调控因子也待进一步研究。

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（責任编辑：编辑唐慧）