血清c-kit mRNA水平与扩张型心肌病并发心力衰竭患者心肌纤维化、心功能及预后的关系*

张展玮,张 军,邢雪梅,吴 松,田 焕

1.三二〇一医院医学检验科,陕西汉中 723000;2.北京中医药大学孙思邈医院心内科,陕西铜川 727100

扩张型心肌病(DCM)作为一种异质性心肌病,其临床特征以单侧或双侧心室扩大同时伴有收缩障碍为主,而且心律失常、心力衰竭(简称心衰)等并发症会进一步增加DCM病死率[1-2]。虽然对于DCM的具体发病机制尚未完全阐明,但既往研究已经证实感染、中毒、内分泌失调、代谢紊乱等均是引发DCM的高危因素,而且越来越多的研究表明遗传因素也是DCM的病因[3-4]。血清干细胞因子(SCF)是由骨髓基质细胞所产生的一类多功能细胞因子。血清干细胞因子受体(c-kit)作为原癌基因编码的Ⅰ型跨膜糖蛋白受体,在促进人体组织发育、生长及凋亡中具有重要作用。c-kit对心肌损伤具有逆转作用,而且在动物模型实验中证实心衰大鼠的c-kit表达明显降低,但其在DCM患者中的研究报道较少[5-6]。DCM病理过程核心是以心肌纤维化及心室重构为主,因此本研究通过探讨c-kit与DCM并发心衰患者心肌纤维化、心功能、预后的关系,以期为该病的发病机制研究及治疗方案的制订提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 将2020年5月至2022年6月于三二〇一医院接受治疗的77例DCM并发心衰患者纳入研究作为研究组,另选取70例未发生过心衰的DCM患者作为对照组,两组一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05),见表1,具有可比性。纳入标准:(1)符合《扩张型心肌病诊断和评估指南》中的DCM的诊断标准[7];(2)心衰的诊断符合《中国心力衰竭诊断和治疗指南2018》中的相关标准[8]且心衰患者的心功能分级为Ⅱ～Ⅳ级;(3)具有完整的临床资料。排除标准:(1)伴有先天性心脏疾病;(2)随访过程中失访;(3)合并其他恶性肿瘤;(4)合并免疫功能障碍。所有纳入研究者均对本研究知情同意,并签署知情同意书。本研究经三二〇一医院医学伦理委员会审核通过(伦理批号:20200119)。

表1 两组一般资料比较[n(%)或

1.2方法

1.2.1实时荧光定量PCR(qPCR)检测血清c-kit mRNA水平 于清晨采集纳入研究者空腹外周血5 mL,以3 500r/min(离心半径13.5 cm)离心10 min,收集到上层血清标本。采用Trizol法提取血清总RNA。PCR反应条件:95 ℃ 预变性5 min,95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s,共40个循环。用ABI公司StepOnePlus qPCR系统进行检测,以GAPDH为内参。GAPDH引物序列上游为5′-GGGAGCCAAAAGGGTCAT-3′,下游为5′-GAGTCCTTCCACGATACCAA-3′,扩增产物长度为720 bp;c-kit引物序列上游为5′-CTAGCCAGAGACATCAGGA-3′,下游为5′-CCATAGGACCAGACATCAC-3′。采用2-ΔΔCt法计算血清c-kit mRNA相对水平。

1.2.23种心肌纤维化指标的检测 3种心肌纤维化指标[α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白]的检测采用酶联免疫吸附法(ELISA)。收集纳入研究者静脉血标本,抗凝处理后放入离心机中,设置离心参数为3 500 r/min(离心半径15 cm),离心10 min,离心完毕后分离上层血浆,置于-20 ℃的环境下储存备用。采用双抗夹心法进行检测,TMB显色后使用酶标仪(美国Bio-Rad公司)在450 nm波长处检测吸光度(A)值,采用CurveExpert软件进行分析,根据直线回归方程计算各指标实际水平。

1.2.3超声心动图分析获取心功能参数 采用彩色多普勒超声诊断仪(美国GE公司,Vivid 7型)获取超声心动图,探头为S5-1,设频率为1.0～5.0 MHz,要求所有受检者均采取左侧卧位,依次检测患者左心室射血分数(LVEF)、左心室舒张末期容积(LVEDV)、左心室收缩末期容积(LVESV)。

1.2.4随访、主要不良心血管事件(MACE)的评定及分组 研究组患者出院后,由本科室1位工龄超过5年的护士通过电话、走访等方式进行随访,随访时长为6个月,随访截至2022年12月。随访期间发生心绞痛、急性心肌梗死、严重心律失常、急性心衰、冠心病死亡等视为发生MACE[9]。随访期间若发生MACE的患者纳入预后不良组,未发生MACE的患者纳入预后良好组。

1.3观察指标 (1)比较研究组与对照组的血清c-kit mRNA水平、心肌纤维化指标及心功能参数;(2)血清c-kit mRNA水平与心肌纤维化指标及各心功能参数之间的相关性;(3)比较预后良好组与预后不良组血清c-kit mRNA水平、心功能参数、心肌纤维化指标水平及临床资料;(4)分析影响DCM并发心衰患者预后的危险因素;(5)分析血清c-kit mRNA水平用于评估DMC并发心衰患者预后的效能。

2 结 果

2.1研究组与对照组血清c-kit mRNA水平比较 研究组血清c-kit mRNA水平低于对照组,差异有统计学意义(0.68±0.15vs.1.15±0.18,t=-17.253,P<0.001),见图1。

图1 研究组与对照组血清c-kit mRNA水平比较

2.2研究组和对照组心肌纤维化指标水平比较 研究组α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白水平均高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2。

2.3研究组与对照组心功能参数比较 超声心动图分析显示,研究组LVEF低于对照组,而LVEDV、LVESV高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),见表3。

表3 研究组与对照组心功能参数比较

2.4血清c-kit mRNA水平与心肌纤维化指标、心功能参数的相关性分析 Pearson相关分析显示,研究组血清c-kit mRNA水平与3种心肌纤维化指标(α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白)、LVEDV及LVESV均呈负相关(r=-0.725、-0.748、-0.744、-0.745、-0.662,P<0.05),与LVEF呈正相关(r=0.677,P<0.05)。见表4和图2、3。

图2 血清c-kit mRNA水平与心肌纤维化指标的相关性

图3 血清c-kit mRNA水平与心功能的相关性

表4 血清c-kit mRNA水平与心肌纤维化指标及心功能参数的相关性分析

2.5预后良好组与预后不良组血清c-kit mRNA水平、心功能参数、心肌纤维化指标水平及临床资料比较 随访期间研究组共有21例患者发生MACE,纳入预后不良组;另外56例未发生MACE,纳入预后良好组。两组间血清c-kit mRNA水平、LVEF、3种心肌纤维化指标水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05),见表5。

表5 预后良好组与预后不良组血清c-kit mRNA水平、心功能参数、心肌纤维化指标及临床资料比较

2.6多因素Logistic回归分析影响DCM并发心衰患者预后的因素 将2.5中差异有统计学意义的指标纳入分析作为自变量(以所有患者各指标水平的平均值作为分界点),是否发生MACE作为因变量,各变量赋值情况见表6。Logistic回归分析显示,血清c-kit mRNA水平为DCM并发心衰患者预后的独立影响因素(P<0.05),见表7。

表6 多因素赋值表

表7 Logistic回归分析DCM并发心衰患者发生MACE的影响因素

2.7ROC曲线分析血清c-kit mRNA水平用于评估DCM并发心衰患者预后的效能 ROC曲线分析显示,血清c-kit mRNA水平用于评估DCM并发心衰患者预后的截断值为0.660,灵敏度为82.80%,特异度为81.80%,曲线下面积为0.829(95%CI:0.745～0.912,P<0.001),具有较高的效能,见图4。

图4 血清c-kit mRNA水平用于评估DCM并发心衰患者预后的ROC曲线分析

3 讨 论

DCM主要特征为心功能下降、心肌受损和心室扩大,其病因尚未完全明确。随着医疗水平的不断进步,现阶段可以有效延长DCM患者的生存期,但其仍是心衰和心脏移植的重要原因之一,给患者及社会带来沉重负担[10]。目前临床对于此类疾病,最常用的治疗手段为抗心衰、抗心律失常治疗,对于心衰症状较重的患者则考虑进行心脏移植或人工心脏辅助等治疗,但以上治疗方式均只能对临床症状起到缓解作用,并不能完全治愈[11]。随着分子生物学研究的不断开展,关于干细胞在各种疾病中的作用成为研究热点。c-kit作为心肌干细胞的生长因子受体,参与心肌细胞增殖过程调控[12]。目前,c-kit与DCM并发心衰关系的研究报道较少。

本研究结果显示,与对照组比较,研究组血清c-kit mRNA水平明显降低。这与GHANIMATI等[13]在小鼠模型中的研究结论一致。该项研究的结果显示,增加细胞c-kit表达水平可以增强对心脏的保护,减少心脏损伤。c-kit阳性的细胞在受到刺激时,不断分化成为内皮细胞、心肌细胞等修补受损的心脏,但随着疾病程度的不断加重,c-kit在心肌梗死的刺激下分化成为心肌细胞的能力降低,无法有效分化为心肌细胞发挥修补心脏的作用[14]。国内虽鲜见研究报道血清c-kit mRNA水平与DCM并发心衰患者预后不良的关系,但国外有研究显示,c-kit水平降低与心脏保护功能减少有关[15]。本研究通过比较预后良好组与预后不良组患者的临床资料和各项指标并进行多因素Logistic回归分析,发现血清c-kit mRNA水平降低是影响DCM并发心衰患者预后的独立危险因素。c-kit水平与心室重构具有一定相关性,心室重构会诱导产生炎症反应,大量炎症因子释放会抑制c-kit及miR-21 mRNA表达,而c-kit及miR-21作为与心室重构具有密切联系的基因,其表达被抑制后将无法进一步发挥促进心肌细胞增值、分裂的作用,进而导致患者预后不良[16]。因此,检测血清c-kit水平有助于评估DCM并发心衰患者预后。

心肌纤维化作为心衰过程中发生的病理变化之一,主要由持续且反复加重的心肌缺血、缺氧所致。本研究显示,研究组α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白及Ⅲ型胶原蛋白水平均明显高于对照组。以上3个指标均为心肌纤维化的常见标志物,其在健康者的组织中表达水平均较低。当DCM患者并发心衰则表示其心室可能发生异常重构,心肌成纤维细胞随之大量释放入血,α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白及Ⅲ型胶原蛋白水平则会明显上升[17]。由于α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白及Ⅲ型胶原蛋白水平升高会加速心室重构,进一步促使炎症反应加重及炎症因子的释放,而c-kit的表达也会随着炎症因子表达的升高而降低,因此c-kit与α-SMA、Ⅰ型胶原蛋白及Ⅲ型胶原蛋白表达呈负相关[18]。另外,通过对两组患者的心功能参数进行检测和比较,发现LVEDV、LVESV与血清c-kit mRNA水平呈负相关。分析原因:LVEDV及LVESV反映了左心室舒张与收缩末期的充盈量,DCM并发心衰患者心肌细胞受损,心肌运动协调性失衡,收缩与舒张能力降低,造成留于心室内的血液容积增加,导致炎症因子水平上升,进而抑制c-kit的表达[19]。LVEF是临床中评价左心室收缩功能的主要指标之一。DCM并发心衰患者心脏收缩、舒张功能减退,导致冠状动脉所支配的心肌区域血流量减少,引起冠状动脉微血管部分循环功能发生障碍,进一步加速心室重构。因此,本研究结果中LVEF与血清c-kit mRNA水平呈正相关。ROC曲线分析显示,血清c-kit mRNA水平用于评估DCM并发心衰患者预后的灵敏度为82.80%,特异度为81.80%,曲线下面积为0.829,具有较高的效能,表明血清c-kit mRNA水平具有成为DCM并发心衰患者预后评估指标的潜在价值。

综上所述,DCM并发心衰患者血清c-kit mRNA水平下调,并且与心肌纤维化及心功能有关,同时血清c-kit mRNA水平降低还预示着预后不良。临床医生可通过定时检测血清c-kit mRNA水平掌握患者病情发展及对预后进行评估。但本研究还存在一定局限性,例如样本量较少,有待进一步开展前瞻性多中心队列研究以验证结论的可靠性,而且本研究仅为临床研究,还需进一步开展基础研究从分子机制的角度对结论进行验证。