富血小板纤维蛋白对大鼠骺板软骨细胞增殖和分化的影响

贾赛雄 利春叶 洪意侠 翁启文 吴迪 龙海泉 陈金仁

骺板是儿童骨折的好发部位，涉及骺板的骨折存在骨桥形成的风险。为避免骨桥复发，骨桥切除后留下的空腔目前多采用脂肪、骨水泥等填塞，临床效果不一[1]。组织工程骺板在治疗骺板损伤方面虽然取得了一定的实验效果，但仍存在着诸多问题，比如，支架材料的选择仍难以满足多方面要求，外源性的细胞因子价格昂贵限制了其实验应用。对此，富血小板纤维蛋白 ( platelet-rich fibrin，PRF ) 是否能满足组织工程骺板的要求呢？PRF 具有三维结构，它既可以作为支架材料又可以产生细胞因子。为此，笔者通过体外实验，在 PRF 的作用下体外培养骺板软骨细胞，探讨了 PRF 在骺板软骨细胞增殖、分化以及生物学行为等方面的作用，现报道如下。

材料与方法

一、主要试剂与仪器

icell 原代软骨细胞培养基 ( 赛百慷公司 )，二甲基砜 ( dimethyl sulfoxide，DMSO ) ( Sigma 公司 )，CCK-8 试剂 ( cell counting kit-8，CCK-8 ) ( 日本同仁 )，COL Ⅱ antibody ( Proteintech 公司 )，细胞糖胺聚糖 ( glycosaminoglycan，GAG ) 总含量二甲基亚甲基蓝比色法定量检测试剂盒 ( Genmed 公司 )，多聚甲醛 ( platelet-rich fibrin，PFA ) ( Solarbio 公司 )，胎牛血清 ( fetal bovine serum，FBS )、Pen Strep、胰酶 ( Gibco 公司 )，Ⅱ 型胶原酶、24 孔板专用细胞爬片、Triton X-100、山羊血清、DAPI 试剂( 4,6-diamino-2-phenyl indole，DAPI ) ( Solarbio 公司 )，Fluoromount-G 荧光封片剂 ( SourthernBiotech 公司 )，低速台式离心机 ( L550，湘仪公司 )，二氧化碳培养箱 ( Heal Force HF151，上海力申公司 )，荧光倒置显微镜 ( Mshot MF53，明美公司 )，酶标仪 ( MR-96A，Mindray 公司 )。

二、实验方法

1. 骺板软骨取材及细胞培养：颈椎脱臼法将大鼠 ( 2 周龄 SD 大鼠 4 只，深圳拓普生物提供 ) 处死，超净台内无菌条件下去除四肢皮肤、肌肉、骨膜，从股骨远端及胫骨近端分离骺板软骨，将骺板软骨组织剪碎，用磷酸盐缓冲盐水 ( phosphate buffered saline，PBS ) 清洗若干次，用 0.1% Ⅱ 型胶原酶与 0.25% trypsin 37 ℃ 水浴震荡消化 1.5 h。用培养基 ( DMEM / F12 + 10% FBS + 1% P / S ) ( DMEM：dulbecco’s modified eagle medium ) 中和，1000 r / min离心 3 min，收集组织，加入 0.1%、4 ℃ 的 Ⅱ 型胶原酶，置于 37 ℃、5% CO2、饱和湿度 95% 的培养箱中过夜消化，期间每小时震荡离心管 1 min。

取出过夜消化的组织，吹打若干次，过 100 μm筛网，收集滤液、离心、重悬沉淀。将细胞置于培养皿中，加入 DMEM / F12 + 10% FBS + 1% P / S，置于37 ℃、5% CO2、95% 湿度的培养箱，24 h 后换液。当生长面积达培养皿的 80%～90% 时进行传代。

2. 细胞形态学观察：在倒置相差显微镜下观察各代细胞的形态及贴壁情况，记录软骨细胞生长状态和形态变化。

3. 骺板软骨细胞荧光鉴定：原代细胞爬片后将盖玻片取出，4% PFA 于 4 ℃ 固定 30 min，PBS 漂洗，破膜封闭液 ( 0.5% Trition X-100 与 PBS 1∶1混合，再加 10% 血清配成 ) 封闭 2 h。加入 Ⅱ 型胶原抗体 ( 与 PBS 1∶100 )，4 ℃ 湿盒孵育过夜。PBS 漂洗，加入四甲基异硫氰酸罗丹明 ( tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC ) 标记的荧光二抗( 1∶50 )，室温避光孵育 1 h。PBS 漂洗，滴加 DAPI染色液，避光孵育 20 min，滴加 Fluoromount-G 封片，荧光显微镜下观察，采集图像。

4. PRF 的制备：将 8 周龄的 SD 雄鼠 ( 1 只，深圳拓普生物提供 ) 麻醉，75% 酒精消毒，在超净台中剪开腹腔，从腹主动脉取血 10 ml 迅速放入离心管中，采用无菌且不添加任何抗凝或促凝剂的离心管放入离心机中，2000 rpm 离心 10 min，离心后的血液分为三层，中间层呈淡黄色凝胶状即 PRF，取出后减去尾端带红细胞成分置于无菌试管中，称重后加入 PBS，-80 ℃ 储存备用。

5. 实验分组：对照组在培养基中不加 PRF，实验组在培养基底部加入 PRF 膜。

6. CCK-8 检测细胞增殖：取第三代细胞培养，当细胞密度达到约 90% 时弃培养基，加入 1 ml 0.25% 胰酶消化至细胞变圆刚要脱落时用完全培养基终止消化，消化计数。以每孔 1800 个细胞接种到96 孔板中，用 PBS 洗涤后，添加含有 10% FBS 的DMEM ( 每孔 200 μl )。每组平行设 6 次重复 ( 即 6 个时间点，每个时间点铺一块板 )，每组每次 6 个复孔，将培养板放在培养箱中培养 ( 37 ℃，5% CO2)。

细胞贴壁后记为 0 h，实验组更换为含 PRF 的培养基，对照组、实验组分别于细胞贴壁后 0 h、24 h、41 h、48 h、65 h 和 72 h 进行 CCK-8 检测。检测时取出 96 孔板，向培养孔分别加入 10 μl CCK-8 溶液，置于培养箱中孵育 1.5 h，用酶联免疫吸附测定 ( enzymelinked immunosorbent assay，ELISA ) 读取器测量 450 nm处的吸光度，以此计算相对增殖率。

7. 划痕实验检测细胞迁移：取第三代细胞培养，当细胞密度达到约 90% 时，弃培养基，加入1 ml 0.25% 胰酶消化至细胞变圆刚要脱落时用完全培养基终止消化，消化计数。先用 marker 笔在 6 孔板背后，用直尺均匀划横线，每隔 0.5 cm 一道，横穿过孔。每孔穿过 3 条线。以每孔 50 万个细胞接种到 6 孔板中，将培养板放在培养箱中培养过夜( 37 ℃，5% CO2)。第 2 天，用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，保证每孔最终统计数据至少 3 个缺口。

用 PBS 洗涤 3 次，去除划下的细胞，对照组加入无血清的 DMEM / F12 培养基，实验组加入含PRF 的 DMEM / F12 培养基，放入 37 ℃、5% CO2培养箱。加入培养基时计为 0 h，于 0 h、24 h、48 h 拍照。用 Image J 进行统计分析并进行伤口闭合度评估。伤口闭合度 = [ 间隙面积 ( 0 h ) - 间隙面积 ( Xh ) ] /间隙面积 ( 0 h )。

8. 硫酸 GAG 含量检测：以每孔 10 万个细胞铺6 孔板 4 个孔 ( 每组 2 个孔 )，细胞过夜贴壁后实验组培养基加入 PRF，处理时间为 24 h 和 48 h。按照细胞 GAG 总含量二甲基亚甲基蓝比色法定量检测试剂盒的方法对待测样品作预处理，并构建标准曲线：纵坐标 ( Y 轴 ) 为吸光度值，横坐标 ( X 轴 ) 为标准 GAG 含量。移取 50 μl 上述预处理的待测样品到 1.5 ml 离心管。按试剂盒方法获得样本吸光度值。根据标准曲线获得样品消化液中硫酸 GAG 的含量 ( μg / ml )。

三、统计学处理

使用 SPSS 19.0 软件包对 CCK-8、划痕实验、硫酸 GAG 含量检测结果采用双因素方差分析 ( two-way ANOVA ) 进行比较，数据均用±s表示，P＜ 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、细胞形态学观察

原代细胞镜下呈球状，继续培养后可部分贴壁( 3～4 h )，1 天后大部分软骨细胞为梭形及多角形，细胞边缘轮廓清晰，具有折光性，当 80%～90% 的骺板软骨细胞贴壁后即可进行传代培养。随着细胞传代，细胞增殖速度显著，变形明显，梭形为主，边缘模糊，折光性变弱。

二、细胞免疫荧光鉴定结果

免疫荧光检测原代骺板软骨细胞中的 COL Ⅱ 表达，发现荧光强度高，经免疫荧光鉴定，该细胞纯度达 90% 以上 ( 图1 )。

图1 a、b：直接免疫荧光鉴定 ( × 100 )；c、d：直接免疫荧光鉴定 ( × 200 )Fig.1 a - b: Direct immunofluorescence identification ( × 100 ); c - d: Direct immunofluorescence identification ( × 200 )

三、CCK-8 实验检测细胞增殖

与对照组相比，实验组 PRF 作用 24 h 时，两组相对增殖率比较差异有统计学意义 (P＜ 0.05 )，实验组增殖速度较慢；两组细胞在 41 h 时相对增殖率差异无统计学意义 (P＞ 0.05 )，但实验组 41 h 与24 h 比较差异有统计学意义 (P＜ 0.05 )，说明 41 h比 24 h 的增殖速度有明显提高；实验组 48 h，与本组 41 h 及对照组 48 h 的相对增殖率比较，差异有统计学意义 (P＜ 0.05 )，说明实验组 48 h 增殖速度显著升高；实验组 65 h 与 72 h 比较差异无统计学意义 (P＞ 0.05 )，但与本组 48 h 及对照组 65 h 及 72 h比较，增殖速度显著升高，差异有统计学意义 (P＜0.05 ) ( 表1 )。

表1 CCK-8 实验中对照组、实验组各时间点细胞相对增殖率比较 ( % )Tab.1 Comparison of the relative cell proliferation rates between the control group and experimental group at different time points in CCK-8 experiment ( % )

四、划痕实验检测细胞迁移

对照组与实验组 24 h 和 48 h 伤口闭合度的两两比较，差异均有统计学意义 (P＜ 0.05 )，说明实验组在 48 h 内随着 PRF 的持续作用时间增加，细胞迁移速度提高，且较对照组显著升高 ( 表2 )。

表2 划痕实验对照组、实验组各时间点伤口闭合度比较 ( % )Tab.2 Comparison of wound closure at different time points between the control group and experimental group by scratch test ( % )

五、硫酸 GAG 含量检测

实验组 PRF 作用 24 h 时，与对照组相比，两组之间的 GAG 含量差异无统计学意义 (P＞ 0.05 )；PRF 作用 48 h，实验组的 GAG 含量显著升高，与本组 24 h、对照组 24 h 和 48 h GAG 含量比较差异均有统计学意义 (P＜ 0.05 ) ( 表3 )。

表3 硫酸 GAG 含量检测比较 ( μg / ml )Tab.3 Comparison of GAG content in sulfuric acid ( μg / ml )

讨 论

骺板是儿童骨折的好发部位，涉及骺板的骨折存在生长停滞和成角畸形的风险。骺板损伤后期如果出现生长停滞、骨桥形成、成角畸形，则需要手术解决生长停滞及成角畸形的问题。为避免骨桥复发，骨桥切除后留下的空腔该如何处理，国内外对填充物材料的选择包括组织工程骺板进行了较多研究，效果都不尽如人意。PRF 作为一种天然生物材料引起了广泛的关注，它可以提供生长因子 ( growth factor，GF )、细胞因子、免疫细胞及干细胞样细胞，用于免疫调节和组织愈合[2]。

PRF 所含的白细胞不仅在免疫和抗炎中起关键作用，而且在伤口愈合过程中也起关键作用[3-4]。与一代血小板浓缩物富血小板血浆 ( platelet-richplasma，PRP ) 相比，PRF 为固态，PRP 为液态，PRF 制备简单、离心过程无需添加其它试剂，很好地避免了过敏反应、免疫排斥、交叉感染等。PRF 的 GF 持续释放速率较 PRP 慢，至少持续释放 7 天，长者能达到28 天左右[5]。PRF 均匀的三维网格组织通过缓慢释放细胞因子，而对组织愈合产生长期影响[6]。Kang 等[7]发现 PRF 的蜂窝结构包含许多小空间，可以容纳移植细胞，作为细胞增殖和分化的支架[8]。外源性的细胞因子价格昂贵，PRF 来自于自体，成本低，其血小板浓度高于血液基本水平，在血小板 α 颗粒储存和释放的生物活性分子中，包含以下最常用于组织再生的 GF：血小板源性生长因子 ( platelet-derived growth factor，PDGF )，胰岛素样生长因子 ( insulin-like growth factor 1，IGF-1 )，转化生长因子 β1 ( transforming growth factor-β1，TGF-β1 )，血管内皮生长因子( vascular endothelial growth factor，VEGF )，碱性成纤维细胞生长因子 ( basic fibroblast growth factor，BFGF )和表皮生长因子 ( epidermal growth factor，EGF )[9]。除了富集血小板和白细胞外，还发现在纤维蛋白网络内具有高再生潜力的干细胞样细胞[10-11]。国外有研究还证实了血小板来源的 GF 可以刺激软骨细胞的体外增殖和分化[12-14]，亦可促进软骨的体内愈合[15-17]。

本研究采用 CCK-8 检测 PRF 作用下骺板软骨细胞的增殖情况，由结果可知，24 h 时，实验组的细胞增殖速度比对照组较慢 (P＜ 0.05 )，实验组 24 h 之后增殖速度开始加快，两组细胞在 41 h 的增殖速度达到一致水平 (P＞ 0.05 )，在 48 h 实验组相比对照组增殖速度显著变快，之后，实验组细胞增殖速度更快，在 65 h 达到增殖顶峰，实验组 72 h 与 65 h 增殖速度无显著差异 (P＞ 0.05 )。结果表明，PRF 可促进骺板软骨细胞的增殖，该结果与先前文献一致[13]。

划痕实验是研究细胞迁移的首选方法，它的实验设计成本低且简单，实验条件可控。划痕实验涉及在多孔试验板中培养单层细胞以使其融合。在单层中创建一个“伤口”( 无细胞区域 )，细胞可以迁移到其中，并可以监测划痕区域的重新定殖以量化细胞迁移。本研究采用划痕实验检测 PRF 对于骺板软骨细胞迁移的影响，结果提示，实验组在 48 h 内随着 PRF 的持续作用时间增加，细胞迁移速度提高，且较对照组显著升高。说明 PRF 可以明显促进骺板软骨细胞的迁移。

GAG 是由重复双糖组成的线状多糖，根据其双糖单位可分为硫酸软骨素 ( chondroitin sulfate，CS )、硫酸皮肤素 ( dermatan sulfate，DS )、硫酸肝素 ( heparin sulfate，HS ) 和肝素。这种结构多样性在骨骼组织的发育、生长和稳态等一系列生物学功能中起着重要作用，是评价软骨功能的重要指标[18]。本研究采用二甲基亚甲蓝比色法对 GAG 进行测定，结果说明在24 h 内 PRF 并没有对 GAG 的产生起到明显作用，但在之后明显促进了 GAG 的产生，在 PRF 的作用下 48 h 时实验组的 GAG 含量明显增多。

由以上结果可见，细胞 24 h 的增殖与迁移趋势结果不太一致，在增殖实验中，24 h 对照组的增殖速度快，实验组 24 h 增殖速度反而没有那么快；而在迁移实验中，24 h 实验组细胞迁移速度更快。可能原因：一是实验组 24 h PRF 暂时只影响到了细胞迁移，对增殖影响不明显，细胞增殖快并不代表迁移也快；二是迁移实验用的血清浓度和增殖实验的血清浓度不一样，高血清浓度使得对照组的细胞增殖速度加快。

根据实验结果得出，PRF 不仅可以促进骺板软骨细胞增殖分化，还可以促进 GAG 的产生。但本研究也存在其缺陷，CCK-8 增殖实验由于实验组 65 h与 72 h 细胞增殖速度无显著差异，那么 72 h 后细胞增殖速度是怎样变化的呢？划痕实验及 GAG 测定的时间太短，仅有 48 h，在 48 h 后 PRF 起到的作用如何也尚不确定。故仍需进一步探索。

综上所述，自体 PRF 具有良好的生物降解性和相容性，富含高浓度的血小板、多种 GF、纤维蛋白原和免疫细胞，在组织工程中既含有细胞因子，又可作为生物支架材料。本研究旨在 PRF 作用下对大鼠骺板软骨细胞进行体外培养，为进一步探讨构建组织工程骺板软骨做准备，为骺板损伤治疗提供新的思路。