基于网络药理学和分子对接预测红花绿绒蒿活性成分抗肝纤维化的作用机制*

娘格才让,索朗拉宗,卓玛措毛,格拉措,才让南加

(西藏藏医药大学,西藏 拉萨 850000)

肝纤维化作为肝损伤转变成肝硬化或肝癌的中间环节,是肝损伤后必经的病理阶段[1]。有研究表明,肝纤维化的早期具有可逆性,处于肝脏疾病的早期预防与治疗过程中的关键时期[2]。肝损伤是一个慢性、长期的过程,各种内外因素对肝脏造成损伤后,其自身进行修复时进入肝细胞损伤、慢性炎症、纤维组织增生三环节的重复循环,造成细胞外基质(ECM)过度增生与异常堆积后形成肝纤维化等肝脏疾病[3]。而传统的藏医药作为具有独立理论系统和特色的治疗方法,能结合现代技术为肝纤维化的治疗提供思路。藏医药理论认为,肝脏疾病的外因多由感受湿热疫毒之邪所致,内因则与患者正气虚弱有关[4]。长期的不良饮食、作息及染湿热毒之邪,导致“三因”失调,以热性“赤巴”盛行,造成肝损伤。肝脏作为血液和精华所藏之腑,藏医将其归为五源中的“火”,属于“赤巴”范畴,本性为“热”,在临床治疗时多以清热解毒为治疗方法。

红花绿绒(Meconopsis punicea Maxim)为罂粟科绿绒蒿属植物,是藏药“欧贝”类药材之一。藏药中绿绒蒿属的“欧贝”类药材是治疗肝脏疾病的一种常用药材,《四部医典》《晶珠本草》将藏药“欧贝”归为花类药材,具有清肝热和肺热、治热邪引起的喉阻塞等功效[5-6]。现代研究表明,红花绿绒蒿含有黄酮类化合物、生物碱、挥发油等多种化学成分,其95%乙醇提取物能显著改善脂多糖诱导的肺损伤小鼠的病理形态[7]。SHANG等[8]通过研究证明,红花绿绒蒿花的醇提物具有良好的镇痛、镇静、镇咳和祛痰作用。目前,从“欧贝”类药材红花绿绒蒿中分离鉴定出26种化合物[9-10],但其活性成分和作用机制尚不明确。因此,本研究基于网络药理学和分子对接技术初步探讨红花绿绒蒿抗肝纤维化的作用机制,为更深层次地研究红花绿绒蒿的肝保护药效物质基础和作用机制的筛选提供理论依据。

1 资料与方法

1.1化学成分筛选及靶点预测 借助TCMSP数据库检索预测红花绿绒蒿化学成分,设置参数为口服生物利用度(OB)≥30%和药性(DL)≥0.2进行筛选。对于TCMSP数据库中未找到的化学成分,则使用PubChem数据库获取化合物的3D结构和Smiles格式后,导入SwissTarget数据库得到相应的预测靶点。

1.2肝纤维化靶点筛选 使用关键词“liver fibrosis”,在GeneCards和OMIM数据库中进行搜索。从GeneCards检索结果中筛选relevance score≥5分的靶点,与OMIM数据库的结果合并,并去除重复,得到与肝纤维化相关的作用靶点。然后,与“1.1”项获得的靶点进行交集比对,最终筛选出红花绿绒蒿抗肝纤维化的潜在作用靶点。

1.3蛋白互相作用(PPI)网络构建及关键靶点筛选 利用STRING数据库,设置连接评分(combined score)最小值为0.900,选择“homo sapiens”物种,将红花绿绒蒿与肝纤维化的关键靶点导入,得到PPI关系,然后将相关数据导入Cytoscape3.6.1软件进行可视化分析,并得到PPI网络分析结果。

1.4GO和KEGG富集分析 使用DAVID数据库,对红花绿绒蒿抗肝纤维化的潜在作用靶点进行GO和KEGG富集分析。设定阈值P<0.05,获得富集结果,然后使用R语言的ggplot2包来进行主要生物功能的可视化分析。

1.5“成分-靶点-通路”网络图 利用红花绿绒蒿抗肝纤维化的潜在作用靶点的GO和KEGG富集数据信息,通过Cytoscape3.7.2软件绘制“成分-靶点-通路”图。

1.6分子对接 利用网络拓扑分析筛选得到的核心靶点,通过分子对接验证它们与成分之间的相互作用关系。通过PDB数据库,找到目标蛋白的PDB ID,并从PubChem数据库下载相应成分的三维结构。通过AutoDocktools(v1.5.6)将受体和配体信息导入,进行分子对接,选择结合能较低的构象。使用Pymol2.3.0软件进行可视化分析。

2 结 果

2.1红花绿绒蒿与肝纤维化的共同靶点 通过上述数据库共获得红花绿绒蒿相关靶点117个,肝纤维化相关靶点6 423个,用Venny2.1取得交集后,共获得251个红花绿绒蒿与肝纤维化的共同靶点。

2.2红花绿绒蒿与肝纤维化的PPI网络 借助STRING数据库和导入Cytoscape3.6.1构建 PPI网络图,见图1。拓扑分析显示,核心靶点有PRKCZ、LCK、RXRA、PIK3CA、AKT1、PIK3R1、MAPK3、MAPK1、HSP9OAA1、SRC,度值分别为24、25、26、34、35、36、43、44、45、46。

注:节点代表PPI关系,圆圈越大代表其节点产生的连接越紧密[11]。

2.3GO与KEGG富集分析 对核心靶点与成分进行GO和KEGG富集分析和可视化,规定校正P<0.05为符合标准,将基因GO本体条目按P值进行排序,分别选取前10条绘制条形图,见图2。图中显示,GO富集分析结果包括生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)。BP主要涉及肽基-丝氨酸修饰(peptidy-serine modification)、肽基-丝氨酸磷酸化(peptidy-serine phosphorylation)、蛋白质运输的正向调节(positive regulation of protein transport)和细胞对化学应激的反应(cellular response to chemical stress)等;CC主要包括细胞膜筏(membrane raft)、细胞膜微域(membrane microdomain)、膜区域(membrane region)、细胞突触前膜的完整组成部分(integral component of presynaptic membrane)等;MF包括蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶的活性(protein serine/threonine kinase activity)、核受体活性(nuclear receptor activity)、配体激活的转录因子活性(ligand-activated transcription factor activity)及药物结合(drug binding)等。KEGG富集分析主要涉及糖尿病并发症AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、脂质与动脉粥样硬化(lipid and atherosclerosis)、化学致癌-受体激活通路(chemical carcinogenesis-receptor activation)和PI3K-AKT信号通路(PI3K-AKT signaling pathway)等,见图3。

图2 GO富集分析

图3 KEGG通路富集分析

2.4“成分-靶点-通路”网络的构建 以251个共同靶点作为红花绿绒蒿抗肝纤维化的作用靶点,通过运用Cytoscape3.6.1软件构建“成分-靶点-通路”网络,见图4。由此表明,红花绿绒蒿可能通过多成分、多靶点及多通路相互线图作用于肝纤维化疾病。此外,筛选度值前5的有效成分,包括木犀草素、小麦黄素、芹菜素、小檗碱、3-甲基联苯,度值分别为101、101、101、100、79。

注:红色六边形节点代表红花绿绒蒿抗肝纤维化的有效成分,紫色节点代表肝纤维化疾病靶点。

2.5分子对接预测结果 选取度值前4的核心成分与靶点进行对接,结构可视化结果见图5。其中有效成分小檗碱与SRC和MAPK3靶点的结合能分别为-9.0 kcal/mol(1 kcal=4.184 kJ)和-9.7 kcal/mol,木犀草素与HSP90AA1和MAPK1的结合能分别为-9.3 kcal/mol和-9.0 kcal/mol,见表1。

表1 红花绿绒蒿有效成分与关键靶点的分子对接结合能

注:A.SRC-小檗碱;B.HSP90AA1-木犀草素;C.MAPK1-木犀草素;D.MAPK3-小檗碱。

3 讨 论

本研究从TCMSP网站共获得红花绿绒蒿有效成分11个,包括木犀草素、小麦黄素、芹菜素、小檗碱等。其中木犀草素作为一种天然的黄酮类化合物,存在于多种天然植物中,具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗肿瘤、抗癌、肝保护等作用[12-13]。LI等[14]研究发现,木犀草素对转化生长因子-β1(TGF-β1)和血小板衍生生长因子(PDGF)刺激激活的造血干细胞(HSC)和HSC-T6细胞的增殖、迁移、胶原合成及纤维化相关基因表达均有抑制作用。而且木犀草素可诱导HSC细胞凋亡,并增加Caspase-3活性和p53表达,诱导细胞周期G1期阻滞,降低Bcl-2、Cyclin E和P-CDK-2表达。木犀草素能显著抑制PDGF和TGF-β1模拟的AKT和Smad通路的磷酸化。这表明木犀草素在体内外通过多种机制减轻肝纤维化潜力。小麦黄素属黄酮类化合物,普遍存在于禾本科、大戟科等植物中,具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等广泛的药理作用[15]。SEKI等[16]研究发现,小麦黄素通过阻断人的HSC细胞系LI90和活化的HSC细胞周期进程和细胞迁移,抑制PDGF-BB诱导的细胞增殖,减少PDGF受体B和下游信号分子ERK1/2和AKT的磷酸化,显示小麦黄素可能在肝纤维化的HSC靶向治疗或化学预防应用中是有益的。芹菜素是一种主要存在于柑橘类水果、蔬菜、香料和草药中的黄酮类化合物[17],具有抗炎、抗病毒、免疫调节、抗肿瘤和保护肝功能等多种药理作用[18]。JI等[19]研究证实,芹菜素能降低丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平,抑制ECM生成,抑制HSC活化,调节基质金属蛋白酶-2(MMP2)和TIMP1平衡,降低自噬相关蛋白表达,抑制TGF-β1/Smad3和p38/PPARα通路,从而减轻肝纤维化。小檗碱是许多中药的一种常见活性物质,小檗碱对脏器损伤和心血管疾病及代谢性疾病的相关并发症、炎症等具有保护作用[20]。TAN等[21]研究发现,小檗碱显著诱导HSC凋亡,促凋亡标志物p53、Bax和PARP的表达上调,抗凋亡标志物Bcl-2的表达下调,ATG5的过度表达逆转了这种作用。在体内,小檗碱通过减少胶原沉积、炎性细胞浸润、纤维化标志物羟脯氨酸、α-平滑肌肌动蛋白、Ⅳ型胶原和自噬标志物LC3的表达来改善肝纤维化的新机制。

红花绿绒蒿有效成分的靶点与肝纤维化疾病靶点进行交集分析,得到共同靶点251个,度值较大的核心靶点有SRC、HSP9OAA1和MAPK1等。SRC激酶家族由非受体酪氨酸激酶组成,广泛存在于各种细胞中。SRC最初被鉴定为癌基因,并在人类肿瘤中表达,然而,其也在所有细胞类型中普遍表达。SRC磷酸化信号蛋白STAT3、AKT和表皮生长因子受体,从而调节各种生物活性,包括细胞存活、增殖和迁移[22-23]。SRC的激活引起肺、肝和肾纤维化,表明SRC激活是纤维化疾病的病理观察[24]。采用HSP90AA1抑制剂可诱导HSC细胞的凋亡,表明HSP90AA1的下调可抑制TGF-β的增殖,从而发挥抗肝纤维化作用[25]。 MAPK1即ERK2,是 ERK信号通路的关键节点,通过靶向调控MAPK1的表达可影响肿瘤等多种疾病的发展[26-27]。调控通路中MAPK1的表达会对其下游一些关键信号造成影响,磷酸化激活的MAPK1由胞质转位到核内,激活下游通路蛋白磷酸化,引起细胞多种生物学功能的变化[28]。

通过红花绿绒蒿-肝纤维化交集基因进行GO富集分析表明,红花绿绒蒿有效成分具有蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶的活性、核受体活性、配体激活的转录因子活性、药物结合、蛋白酪氨酸激酶活性、类固醇结合、单羧酸结合、磷酸酶结合-组蛋白激酶活性、激素受体结合等多个生物学功能;同时红花绿绒蒿的有效成分能影响细胞膜筏、细胞膜微域、细胞膜区域、细胞突触前膜的完整组成部分和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合体等多个CC,从而参与肽基-丝氨酸修饰、肽基-丝氨酸磷酸化、蛋白质运输的正向调节、细胞对化学应激的反应等多个BP。KEGG富集分析显示,红花绿绒蒿有效成分可能参与AGE-RAGE、脂质与动脉粥样硬化、化学致癌-受体激活、PI3K-AKT等信号通路。

综上所述,本研究通过网络药理学和分子对接技术,探讨红花绿绒蒿抗肝纤维化的药效物质基础、作用靶点及相关药理机制,揭示了红花绿绒蒿多成分、多靶点及多种通路间协同起效的复杂网络关系。通过构建“成分-靶点-疾病”通路网络,结合分子对接技术,预测出红花绿绒蒿抗肝纤维化可能的作用机制,为后续红花绿绒蒿抗肝纤维化的实验研究提供了理论支持。