宏基因组二代测序对肺部感染诊断价值的中国数据meta分析*

王 洋,牛五层,张晓煜,张 丽△

(1.国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院深圳医院检验科,广东 深圳 518116;2.邯郸市第一医院核医学科,河北 邯郸 056000)

肺部感染是临床常见的呼吸道疾病,发病率高,是导致生命死亡的主要原因之一[1]。尤其在老年人和免疫功能低下的个体中,准确、快速地诊断感染的原因是实现肺部感染治疗和改善预后的关键。传统的培养方法耗时长,阳性检出率低,不能完全满足临床需求[2]。其他的检测方法,如聚合酶链反应(PCR)和免疫学等技术,只能识别特定的病原体。此外,多种病原体的感染和多重耐药菌的出现使病原体的鉴定更加困难。宏基因组二代测序(mNGS)是一种新兴的病原体检测方法,可以对目前已知的所有病原体的总DNA或RNA含量进行无偏倚、详细地检测[3],尤其在用于检测复杂、罕见、非典型的感染性疾病时,显示出比传统方法更好的诊断性能[4]。近年来,mNGS应用于诊断肺部感染的研究逐渐增多,但其诊断性能尚未达成共识。本研究采用meta分析方法,合并目前经公开发表的相关研究结果,评估mNGS在肺部感染中的应用价值及准确性。

1 资料与方法

1.1文献检索策略 计算机检索 PubMed、Embase、the Cochrane Library、中国知网、万方、维普等数据库,检索时限均为建库至2022年5月30日,语种为英文或中文。选取国内外发表的通过mNGS技术应用于肺部感染诊断的文献,并对纳入文献的参考文献进行扩大检索。英文检索词为“metagenomic next-generation sequencing”“mNGS”“next-generation sequencing”“pneumonia”“lung infection”等,中文检索词为“宏基因组二代测序”“二代测序”“肺部感染”“肺炎”等。

1.2纳入与排除标准 纳入标准:(1)采用 mNGS 技术应用于肺部感染诊断的研究,能从文中获取诊断实验的四格表数据,包括真阳性值(TP)、假阳性值(FP)、假阴性值(FN)、真阴性值(TN)。(2)研究对象为疑似肺部感染的患者,且有明确的诊断标准,诊断标准主要包括影像学资料、临床症状和实验室检测结果,最终判断由临床医生进行。研究组为确诊肺部感染的患者,对照组为最终诊断非肺部感染的患者。(3)病例数超过10 例。(4)英文和中文文献。

排除标准:(1)动物实验、会议摘要、病例报告、系统评价类文献。(2)重复发表文献或无法获取四格表数据的文献。

1.3文献的筛选和资料提取 由2位研究员对所有纳入的文献全文进行系统回顾,并提取相应的数据,包括文献作者、发表时间、国家或地区、研究设计类型、纳入的病例数、诊断肺部感染的参考标准、四格表数据等。有异议时通过讨论解决。如果未达成一致,则由第三位评价者做出最终决定。

1.4纳入研究的质量评价 由2位研究员使用RevMan5.3软件根据QUADAS-2条目[5]逐条按“是”“否”“不清楚”对纳入文献的质量进行偏倚风险和适用性评价。QUADAS-2表单包含4个部分:(1)病例的选择;(2)待评价试验;(3)参考标准;(4)病例流程和进展情况。如遇分歧则通过查阅相关资料、内部讨论或咨询专家解决。

1.5统计学处理 采用Meta-Disc1.4、STATA15.0软件进行meta分析。纳入研究通过Cochran-Q检验判断是否存在异质性,检验水准设为0.05,结合I2判断异质性的大小。若P>0.05或I2≤50%,说明纳入研究间异质性较小,可以采用固定效应模型;若P≤0.05或I2>50%,说明纳入研究间异质性较显著,则运用随机效应模型,并分析异质性来源。通过Spearman 相关系数确定纳入研究之间是否存在阈值效应。若Spearman 相关分析显示P>0.05,说明不存在阈值效应。通过亚组分析探索异质性来源。计算纳入文献的合并敏感度、特异度、阳性似然比(PLR)、阴性似然比(NLR)及诊断比值比(DOR)等指标,并绘制总受试者操作特征曲线(SROC),计算曲线下面积(AUC)。发表偏倚通过Deeks 漏斗图评估。

2 结 果

2.1文献检索结果 初步检索到相关文献1 613篇,根据文献排除标准,其中1 571篇在浏览标题和摘要后被排除在外。全文阅读后,另外30篇被排除在外,剩下12篇文献被纳入研究[6-17]。文献筛选流程及结果见图1。

图1 文献筛选过程

2.2纳入研究的基本特征与质量评价 本研究纳入8篇[6-13]英文文献和4篇[14-17]中文文献,均来源于国内相关研究。纳入的12篇文献共包括1 154例患者,其中794例被确诊为肺部感染,360例最终确诊为非肺部感染性疾病。纳入研究的基本特征见表1,利用QUADAS-2所作出的文献质量评价结果见图2。

表1 纳入研究的基本特征

图2 文献质量评价偏倚风险图

2.3meta分析结果

2.3.1mNGS技术应用肺部感染诊断准确性 Spearman相关系数结果显示,r=0.175,P=0.587,提示纳入文献不存在阈值效应。异质性检验结果显示,敏感度(χ2=100.68,P<0.000 1,I2=89.1%),特异度(χ2=75.27,P<0.000 1,I2=85.4%),PLR(Cochran-Q=58.83,P<0.000 1,I2=81.3%),NLR(Cochran-Q=67.16,P<0.000 1,I2=83.6%),DOR(Cochran-Q=54.07,P<0.000 1,I2=79.7%)。见图3～8。各研究间异质性较大,采用随机效应模型进行meta分析。结果显示,合并敏感度为0.82[95%可信区间(95%CI)0.79～0.84],合并特异度为0.73(95%CI0.68～0.78),PLR为2.39(95%CI1.62～3.50),NLR为0.24(95%CI0.15～0.39),DOR为12.66(95%CI5.53～28.99),SROC的AUC为0.850,Q指数为0.782。

图3 纳入研究的敏感度森林图

图4 纳入研究的特异度森林图

图5 纳入研究的PLR森林图

图6 纳入研究的NLR森林图

图7 纳入研究的DOR森林图

图8 纳入研究的SROC

2.3.2亚组分析 所纳入的文献之间具有较高的异质性,利用亚组分析探索异质性来源。按病例组标本量、标本预处理方式、测序方式等进行亚组分析,分析结果见表2。

2.3.3发表偏倚 Deeks 漏斗图大致对称,P=0.63(P>0.05),见图9。提示纳入研究无明显发表偏倚。

3 讨 论

肺部感染是由临床中常见的多种病原微生物引起的感染性疾病之一,发病率及病死率较高[18]。细菌、病毒或真菌等多种病原体与肺部感染相关,对肺部感染的快速微生物学诊断有助于抗菌药物治疗的及时应用。测序技术和生物信息学的快速发展使mNGS成为临床诊断发展的重要领域。

mNGS理论上可以检测临床样本中的所有病原体,现已应用于中枢神经系统、血液、呼吸系统及局部组织感染等的病原体检测中[19]。mNGS具有非靶向性及相对较短的检测周期,能够快速检测到病原体。作为现有传统常规培养及涂片的补充方法,可改善复杂感染患者的病原体检测和疾病管理[20]。此外,在流行病学分析方面,mNGS能够提供病原体的遗传和基因组信息,用于新发和罕见病原体的识别已得到广泛认可[21]。

关于mNGS在诊断肺部感染方面的性能和价值的综合研究逐渐增多,但诊断性能尚未达成共识。因此,本文对mNGS技术在肺部感染诊断的应用价值进行meta分析。

本次最终纳入12篇研究,借助Meta-Disc1.4与STATA15.0软件,选用随机效应模型,评估了mNGS技术在肺部感染诊断的诊断效能。分析结果显示,合并敏感度为0.82(95%CI0.79～0.84),特异度为0.73(95%CI0.68～0.78)。对于肺部感染的研究,敏感度应被特别关注,mNGS通常于常规微生物实验室诊断不明时开展。抗菌药物的使用对mNGS诊断率的影响小于传统培养[22],mNGS在免疫抑制或危重症患者中诊断的敏感度更高[23]。DOR可反映检验项目的结果与疾病之间的关联强度,DOR>1时,其值越大说明判别效果越好[24]。本研究DOR为12.66(95%CI5.53～28.99),似然比为反映敏感度和特异度的复合指标,PLR>10.0或NLR<0.1,可认为诊断精度高[23]。本研究PLR值为2.39(95%CI1.62～3.50),NLR值为0.24(95%CI0.15～0.39),AUC为0.850,Q指数为0.782,总体诊断价值尚可。

本研究亚组分析提示,标本预处理方式、测序方法、病例组标本量大小等亚组均存在较大异质性。由于纳入文献的不足,尚未对研究类型、标本来源、人群免疫状态做进一步分析探索其异质性来源。临床诊断标准因研究而异,可能导致病例分类的变化,影响敏感度和特异度,成为异质性的来源之一。mNGS作为一种无偏倚的检测方法,可以检测环境中的所有病原体,这种测试方法本身并不能区分病原微生物与定植微生物、背景微生物和受污染微生物[24]。检测结果中的大量信息可能会干扰医生做出临床决策。在解释mNGS结果时,应根据临床症状、微生物毒力、病原体reads数量、基因组覆盖率等来区分真正的病原体与定植及污染。不同标本类别下的结果可能存在差异,标本的采集方法和部位的缺乏标准化也可能影响mNGS的结果。有研究指出,由于肺活检样本中存在恶性肿瘤、肺结节或肺阴影等并发症,支气管肺泡灌洗液样本比肺活检样本更容易诊断感染[24];血液样本中的病原体DNA可能反映了肺部感染,也有可能由其他器官感染所致[25];痰液样本极易受到污染,使得背景微生物的识别和测序结果的解读变得困难。此外,mNGS阳性阈值标准尚未确立。在纳入的12项研究中,有7项[6-9,11-12,15]研究对确定mNGS阳性阈值有明确要求,尽管各个要求不完全一致。目前,还没有权威的指南来解释mNGS报告[26],不同解读方式可能对检测结果造成偏倚。因此,制订统一的mNGS阳性阈值标准至关重要。需要更多的研究来尽可能统一定义mNGS阳性的阈值标准。

此外,本研究尚存在以下不足:(1)纳入文献来源仅为中国地区,缺乏地区代表性。(2)纳入文献语种仅包括英文、中文,可能存在语言偏倚。(3)纳入文献较少,且大多为回顾性研究。纳入的部分研究样本量小,评估诊断准确性的能力不足。(4)在亚组分析中存在显著异质性。

综上所述,mNGS在确立肺部感染病因方面表现出的敏感度和特异度尚可,具有广泛的临床应用前景。但目前mNGS技术的应用仍有一些局限性,如测序成本高、阳性阈值的确立、病原体的报告解读等,尚不能取代传统病原体检测方法。本研究纳入文献数量较少,各个研究间的异质性高,尚需进一步大规模高质量的研究,更客观准确地评估mNGS在肺部感染中的诊断价值。