血必净注射液对心脏骤停/心肺复苏后大鼠神经功能及生存情况的影响机制 Δ

黄德庆 ，高玉广 张元侃 王政林 邓海霞 黄夏冰 庞 延 吴 林 （.广西中医药大学第一附属医院急诊科，南宁 53003；.广西中医药大学科学实验中心，南宁 53000）

心脏骤停（cardiac arrest，CA）是全球患者主要的死亡原因之一，是严重的公共卫生问题[1]。随着心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation，CPR）技术的不断发展和进步，CA患者初期恢复自主循环的比例有所提高，但其总生存率并未得到明显改善，且大部分幸存者会出现中、重度神经功能缺损及认知功能障碍，甚至处于植物人状态，给其家庭及社会造成严重的疾病负担。虽然目标温度管理、体外循环支持等技术对CA/CPR 患者脑损伤有益，但临床尚缺乏效果可靠的治疗措施[2―3]。因此，挖掘CA/CPR 后脑保护的治疗靶点和有效干预措施显得尤为重要。

近年来，中医药用于CA救治取得了较好的效果，其中中药制剂——血必净注射液应用广泛[4]。该注射液由红花、赤芍、川芎、丹参、当归5 味中药组成，能改善CA/CPR后患者的器官功能，并降低其死亡率[5―6]，但具体机制尚未明确。S-亚硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）是人体内含量丰富的亚硝基硫醇之一，也是重要生物活性物质一氧化氮（NO）的供体，能阻断脑缺血/再灌注动物模型的炎症反应和继发性脑损伤；同时，GSNO能控制NO 持续少量释放，对CA/CPR 致脑损伤具有改善作用[7]。GSNO的含量受S-亚硝基谷胱甘肽还原酶（Snitrosoglutathione reductase，GSNOR）的调节。近期研究结果表明，抑制CA/CPR后小鼠脑内GSNOR的表达，能够提高其脑内GSNO含量并改善其相关症状[8]。学者在其他病种的研究中发现，血必净注射液能够增加诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的含量，提示该药的药理作用与其调节NO 生物活性有关[9]。因此，本研究拟从GSNOR/GSNO 途径出发，采用高通量测序联合酶联免疫吸附测定（ELISA）验证该途径在CA/CPR大鼠体内的表达情况，并对血必净注射液主要活性成分与GSNOR 进行分子对接；同时，拟以GSNOR特异性抑制剂SPL-334.1为参照，观察血必净注射液对大鼠GSNOR、GSNO 表达的影响，以期明确血必净注射液对CA/CPR 大鼠神经功能及生存情况影响的潜在机制。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所用主要仪器包括ELX808型多功能酶标仪（美国BioTek 公司），CDS9000 型小动物麻醉机（美国SurgiVet 公司），ThermoMixer C 型恒温仪（德国Eppendorf 公司），HPMS 型动物监护仪、定制小动物手术操作系统（美国Harvard公司），NovaSeq 6000型测序系统（美国Illumina公司）等。

1.2 主要药品与试剂

血必净注射液（批号2303031，每支10 mL）购自天津红日药业股份有限公司；SPL-334.1 原料药（货号T28837）购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司；GSNOR、GSNO ELISA 检测试剂盒（货号分别为XEY-35884、FT-101490E）均购自上海梵态生物科技有限公司。

1.3 实验动物

清洁级SD 大鼠160 只，雄性81 只、雌性79 只，体重（200±20）g，购自长沙市天勤生物技术有限公司，生产许可证号为SCXK（湘）2019-0014。本动物实验方案经广西中医药大学实验动物福利伦理委员会审核（批准编号DW20201011-77），符合实验动物福利伦理的相关规定。

2 方法

2.1 模型制备

大鼠禁食不禁水12 h，称重后，腹腔注射3%戊巴比妥（45 mg/kg）麻醉，固定于小动物实验台上，行气管插管并实时监测，记录其呼气末二氧化碳分压；于大鼠右侧股动脉置入PE50管（深度约6 cm），行血压实时监测；以肛温表监测大鼠体温，并使其体温维持在（37.0±0.5）℃；将二导联心电仪电极刺于大鼠皮下，实时监测和记录其心电活动情况。分离大鼠右侧颈外静脉，置入绝缘导管（深度约4 cm），按本课题组前期研究及相关文献[10]方法制备CA/CPR模型：测得大鼠基础状态数据后，于诱颤前先行呼吸机通气5 min（潮气量为6 mL/kg，吸入氧浓度为21%，通气频率为100次/min）；通气结束后，于大鼠右侧颈外静脉绝缘导管中插入金属导丝，通电（2 mA）诱颤，密切观察大鼠心电图及血压情况，及时调整诱颤电流大小及导丝位置，直至大鼠出现室颤心律；诱颤2.5～3 min后，关闭电源，大鼠呈自发室颤（自诱颤心电呈现室颤心电波形开始，持续室颤6 min）。术中，所有大鼠腹腔注射3%戊巴比妥10 mg/（kg·h）行麻醉维持。室颤大鼠在心脏停搏5.5 min时，行呼吸机通气（吸入氧浓度为100%，通气频率为200次/min）；于心脏停搏6 min 时，予胸外按压（按压频率200 次/min，按压深度1 cm，按压部位为剑突上2.8 cm）进行复苏，以平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）≥60 mmHg（1 mmHg＝0.133 kPa）持续5 min视为自主循环恢复[室颤大鼠于按压心脏5 min 后行电击除颤，如除颤后自主循环不能恢复，需静脉注射肾上腺素（每次0.1 mg）；持续按压心脏20 min，除颤3次，自主循环仍不能恢复者，视为复苏失败]。

2.2 差异表达基因检测与验证

取大鼠按“2.1”项下方法造模，作为模型组；另取大鼠只分离右侧颈外静脉并置管而不进行CA/CPR操作，作为假手术组（下同）。取模型组和假手术组大鼠各5只（雄性3只、雌性2只），腹腔注射3%戊巴比妥（45 mg/kg）麻醉后处死，提取其双侧海马组织（55～65 mg），研磨成浆，使用TRizol 液提取RNA，检测纯度和浓度后，制备RNA 文库；参考Illumina DNA Prep 文库制备自动化工作流程，以测序系统测序，剔除低质量的基因并筛除不表达的基因并作标准化处理后，运用DRAGEN Germline Pipeline软件对2组样本的测序数据进行分析，以假手术组为对照，以|log2FC|≥1[FC 为表达量差异倍数（fold change）]、P＜0.05 为标准[11]，借助火山图筛选差异表达基因并确定GSNOR 是否在其中，同时进行主成分分析（principal component analysis，PCA）。随后，参照相应试剂盒说明书，采用ELISA法以酶标仪检测2组大鼠海马组织中的GSNOR、GSNO 含量，以验证差异表达基因的分析结果。

2.3 血必净注射液活性成分筛选

在中药系统药理数据库与分析平台[Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），http：//tcmspw.com/tcmsp.php]和中药综合数据库[Traditional Chinese Medicine Integrated Database（TCMID），http：//119.3.41.228：8000/tcmid/]中搜索血必净注射液组方药材（红花、赤芍、川芎、丹参、当归）所含成分，并运用TCMSP自带的“ADME（absorption，distribution，metabolism，excretion）”筛选功能，以血脑屏障透过率（blood-brain barrier，BBB）≥－0.3、药物相似性评分（drug-likeness weight，DW）＞0.6为标准[12―13]，筛选度值（degree）排前10位的活性成分。

2.4 血必净注射液活性成分与GSNOR的分子对接验证

从TCMSP、TCMID 数据库中获取各活性成分结构的“mol2”格式；运用PDB 数据库（https：//www.rcsb.org）检索成分对应靶点的蛋白构象，使用PyMOL 软件对蛋白进行脱水处理后以“pdb”格式导出；利用AutoDock软件对血必净注射液活性成分与GSNOR 蛋白（PDB 编号3qj52）进行分子对接，评估结合能后使用PyMOL 软件对最优对接结构[结合能越低，结合活性越强；若结合能≤－6 kcal/mol（1 kcal＝4.186 kJ）则表明分子间具有较强的结合活性[14]]进行可视化展示。

2.5 动物实验验证

2.5.1 分组、造模与给药

取大鼠按“2.1”项下方法造模，将造模成功的大鼠分为模型组、抑制剂组、血必净组、血必净+抑制剂组，并设置假手术组，每组30只，雌雄各半。假手术组和模型组大鼠于术后通过颈外静脉注射与血必净组等体积的生理盐水；抑制剂组大鼠于术后通过颈外静脉注射6 mg/kg的SPL-334.1（以生理盐水为溶剂，剂量参考相关文献[8]设置）；血必净组大鼠于术后通过颈外静脉注射4 mL/kg的血必净注射液（剂量参考相关文献[15]设置）；血必净+抑制剂组大鼠于术后通过颈外静脉先后注射SPL-334.1和血必净注射液（剂量同各单药组）；每天2次，连续3 d。

2.5.2 取材

分别于药物首次干预后3 h、24 h、3 d 时，从各组中选取大鼠10 只，腹腔注射3%戊巴比妥（45 mg/kg）麻醉后处死；以仰卧位将四肢固定于解剖板上，开胸后充分暴露心脏，将灌注针头插入左心室，剪开右心耳，同时快速灌注生理盐水100 mL；灌注完毕后于冰上断头取脑，用生理盐水冲去多余血液，在大脑中下1/3 交界处完整剥离双侧海马，迅速放入－80 ℃冰箱中保存，备检。

2.5.3 大鼠神经功能评分及生存情况记录

分别于“2.5.2”项下取材前对各组大鼠进行神经功能评分及生存情况记录。神经功能评分采用改良的神经系统损害严重程度评分表（modified neurologic severity scale，mNSS）：该表总分为18 分，其中0 分为正常、1～6分为轻度损害、7～12分为中度损害、13～18分为重度损害[16]。大鼠生存情况采用Cox 回归分析：使用R 语言的“survival”包进行比例风险假设检验，同时进行生存回归拟合并绘制生存率曲线，使用“survminer”包和“ggplot2”包进行可视化展示。

2.5.4 海马组织中GSNOR、GSNO含量检测

取“2.5.2”项下各时间点各组大鼠的双侧海马组织适量，参照相应试剂盒说明书，采用ELISA 法以酶标仪检测其中GSNOR、GSNO含量。

2.5.5 GSNOR、GSNO含量与mNSS评分相关性评价

运用Pearson 法分析GSNOR、GSNO 含量与大鼠mNSS评分的相关性。

2.6 统计学方法

采用Excel 软件录入数据，SPSS 19.0 软件进行统计分析。符合正态分布且方差齐的计量资料以±s表示，多组间比较采用方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验；不符合正态分布或方差不齐的计量资料以中位数和四分位间距表示，组间比较采用U检验。检验水准α＝0.05。

3 结果

3.1 差异表达基因筛选及验证结果

经对比模型组与假手术组大鼠双侧海马组织的测序结果发现，GSNOR 编码基因在差异表达基因中（图1A）；PCA分析结果显示，假手术组和模型组大鼠样本的离散程度高，两者存在明显差异（图1B）；进一步的ELISA 检测结果显示，模型组大鼠海马组织中GSNOR含量显著高于假手术组，GSNO含量显著低于假手术组（P＜0.01，图1C）。

3.2 血必净注射液活性成分筛选结果

根据“2.3”项下标准，本研究最终筛选出degree排前10 位的活性成分，包括木犀草素、异欧前胡素等，具体见表1。

表1 血必净注射液中degree排前10位的活性成分

3.3 分子对接验证结果

异欧前胡素、去甲丹参酮、鼠尾草酚酮、豆甾醇与GSNOR 具有较强的结合活性，结合能分别为－8.0、－9.2、－8.5、－8.1 kcal/mol，以氢键连接为主。结果见图2（以去甲丹参酮、鼠尾草酚酮为例）。

图2 血必净注射液活性成分与GSNOR的分子对接图

3.4 动物实验验证结果

3.4.1 大鼠神经功能和生存情况

首次给药后3 h、24 h、3 d时，假手术组大鼠的mNSS评分均为0 分；模型组大鼠各时间点的mNSS 评分均显著高于同期假手术组（P＜0.05），且有随时间延长而逐渐降低的趋势；血必净组、抑制剂组、血必净+抑制剂组大鼠的mNSS评分均显著低于同期模型组（P＜0.05），且血必净组显著低于同期抑制剂组，血必净+抑制剂组显著低于同期血必净组及抑制剂组（P＜0.05）。结果见表2。

表2 不同时间点各组大鼠mNSS 评分比较（±s，n＝10，分）

表2 不同时间点各组大鼠mNSS 评分比较（±s，n＝10，分）

组别假手术组模型组抑制剂组血必净组血必净+抑制剂组给药后3 h 0 7.05±0.80a 5.90±0.45b 5.21±0.36bc 4.29±0.82bcd给药后24 h 0 4.46±0.30a 4.31±0.24b 2.86±0.41bc 1.88±0.47bcd给药后3 d 0 3.84±0.75a 2.98±0.58b 2.12±0.62bc 1.17±0.16bcd

a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与抑制剂组比较，P＜0.05；d：与血必净组比较，P＜0.05。

假手术组没有大鼠死亡，模型组在给药后3 h、24 h、3 d时分别有1、3、7只大鼠死亡，共死亡11只；血必净组在上述时间点分别有1、1、2只大鼠死亡，共死亡4只；抑制剂组在上述时间点分别有1、2、3只大鼠死亡，共死亡6只；血必净+抑制剂组仅在首次给药后24 h时有1只大鼠死亡。各组大鼠的生存率曲线见图3。

图3 各组大鼠的生存率曲线

3.4.2 大鼠海马组织中GSNOR、GSNO含量

给药后3 h、24 h、3 d 时，模型组大鼠海马组织中GSNOR 含量均较同期假手术组显著升高，GSNO 含量均较同期假手术组显著降低（P＜0.05）；血必净组、抑制剂组、血必净+抑制剂组大鼠海马组织中GSNOR含量均较同期模型组显著降低，GSNO含量均较同期模型组显著升高（P＜0.05），且抑制剂组较同期血必净组、血必净+抑制剂组较同期血必净组及抑制剂组的变化更明显（P＜0.05）。结果见表3。

表3 不同时间点各组大鼠海马组织中GSNOR、GSNO含量比较（±s，n＝10，pg/mg）

表3 不同时间点各组大鼠海马组织中GSNOR、GSNO含量比较（±s，n＝10，pg/mg）

a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与抑制剂组比较，P＜0.05；d：与血必净组比较，P＜0.05。

组别假手术组模型组抑制剂组血必净组血必净+抑制剂组GSNOR 3 h 0.10±0.02 1.11±0.26a 0.81±0.17b 0.94±0.07bc 0.64±0.13bcd 24 h 0.10±0.02 0.80±0.15a 0.43±0.07b 0.63±0.12bc 0.37±0.08bcd 3 d 0.09±0.02 0.56±0.02a 0.33±0.06b 0.45±0.13bc 0.23±0.07bcd GSNO 3 h 2.31±0.11 0.50±0.02a 0.80±0.01b 0.73±0.04bc 0.98±0.02bcd 24 h 2.33±0.09 0.73±0.20a 1.25±0.05b 1.14±0.14bc 1.38±0.24bcd 3 d 2.30±0.09 1.07±0.11a 1.56±0.33b 1.23±0.22bc 2.23±0.31bcd

3.4.3 GSNOR、GSNO含量与mNSS评分的相关性

GSNOR 含量与大鼠mNSS 评分呈正相关（r＝0.962，P＜0.001），而GSNO 含量与大鼠mNSS 评分呈负相关（r＝－0.914，P＜0.001）。结果见图4。

图4 大鼠海马组织中GSNOR、GSNO含量与其mNSS评分的相关性分析

4 讨论

CA/CPR 是一个复杂的病理生理过程，全脑缺血性损伤是患者最主要的死亡原因[2―3]，但目前该损伤的发生机制尚未明确，故探索相关机制并寻找潜在治疗靶点和有效干预措施具有重要的临床意义。

本研究通过高通量测序分析及ELISA 实验发现，GSNOR编码基因是假手术组和模型组大鼠海马组织样本的差异表达基因之一；CA/CPR 后，大鼠海马组织中GSNOR 含量明显升高，而GSNO 含量则明显降低。研究指出，GSNO对CA/CPR后的脑损伤具有保护作用，其机制与控制体内NO 持续少量释放有关[7]；同时，GSNO的含量受GSNOR的调节，GSNOR可通过降解GSNO而减弱GSNO 的脑保护作用[17]。由此可见，抑制GSNOR表达从而增加体内GSNO 含量，对CA/CPR 后缺血性脑损伤具有改善作用，GSNOR/GSNO 途径可能成为CA/CPR治疗的潜在途径。本研究分子对接结果提示，血必净注射液的活性成分——异欧前胡素、去甲丹参酮、鼠尾草酚酮、豆甾醇与GSNOR有较强的结合活性，提示血必净注射液脑保护作用的发挥可能是通过调控GSNOR的表达而实现的。

基于以上2 项研究结果，本课题组进一步采用动物实验进行验证。结果显示，大鼠CA/CPR 后，除假手术组外，其余各组大鼠均出现了不同程度的神经功能损伤，并可见GSNOR含量升高、GSNO含量降低。经药物干预后，抑制剂组、血必净组、血必净+抑制剂组大鼠各评估时间点的神经功能均有明显改善，生存率明显升高，且GSNOR含量显著低于同期模型组，GSNO含量显著高于同期模型组，提示血必净注射液可抑制GSNOR表达，从而提高体内GSNO 含量并改善CA/CPR 大鼠神经功能，与既往研究结果[7]基本一致。但值得注意的是，既往研究采用的是高钾法建立CA/CPR 模型[7]，高钾法操作相对简单，但所建动物模型可能出现无脉性心电活动或心室静止，和临床上成人CA 初始心律多表现为室颤不符；同时，由于注射氯化钾可引起动物电解质紊乱，故还需进一步考虑电解质紊乱对实验结果的影响。而本研究所用的室颤法是建立CA/CPR 模型的常规方法，由于临床大部分CA 是由室颤引起，故此法所得模型更接近于临床成人CA的病理特点[8，18]。

血必净注射液具有活血化瘀、舒通络脉、溃散毒邪的功效，被广泛用于重症肺炎、重症急性胰腺炎、慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症等危重疾病的临床治疗[19]。血必净注射液所主治瘀毒互结证的中医病机与CA/CPR患者缺血、缺血/再灌注损伤及全身炎症反应的病理改变相符，故该药已被广泛用于CA/CPR后的治疗[4]。本研究结果显示，血必净组大鼠海马组织中GSNOR 含量显著低于模型组，而GSNO 含量显著高于模型组，提示血必净注射液能够抑制GSNOR的表达，进而提高GSNO 含量，从而改善CA/CPR 后大鼠的神经功能并提高其生存率。

本研究还发现，血必净注射液联合GSNOR 抑制剂对大鼠神经功能及生存率的改善效果显著优于单用血必净注射液或单用GSNOR抑制剂，提示联合GSNOR抑制剂能明显提高血必净注射液对大鼠CA/CPR 后脑损伤的干预效果，可为未来的药物研发提供线索。值得注意的是，本研究还发现，抑制剂组大鼠各时间点的GSNOR 含量均显著低于血必净组，GSNO 含量均显著高于血必净组，而各评估时间点的神经功能及生存率均不及血必净组，提示血必净注射液改善CA/CPR 后大鼠神经功能、生存率的作用可能依赖于GSNOR/GSNO 途径，但同时可能涉及其他分子机制，具体情况尚需进一步实验验证。

综上所述，血必净注射液能够改善大鼠CA/CPR 后的神经功能并提高其生存率，其作用与下调GSNOR 并上调GSNO 有关。但血必净注射液这一作用是否还与其他信号通路有关尚需进一步探讨。