黄芪多糖对腹膜透析大鼠腹膜纤维化和血管生成的影响及机制 Δ

冯 雪，彭 斌，冯 立，朱双益，胡 溪，熊 玮，高 智 （武汉市中医医院肾病科，武汉 430014）

腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）常用于终末期肾病的治疗，全球有11%～15%的终末期肾病患者接受PD治疗，在中国接受PD的人群也在逐年增多[1]。PD的前提是腹膜功能具有完整性，但是随着PD 治疗时间的延长，非生理性透析液长期使用，使得患者腹膜通透性随之增加，腹膜超滤功能随之衰竭，最终导致PD治疗失败。其中超滤功能衰竭是终末期肾病患者PD治疗失败的主要原因，而腹膜纤维化及腹膜血管新生在其发生过程中起着重要作用[2]。低氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）/血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）信号通路参与器官组织纤维化及血管生成进程，抑制HIF-1α/VEGF信号通路可以抑制肾小管上皮细胞凋亡，从而抑制肾脏纤维化[3]。由此推测，HIF-1α/VEGF信号通路也可能参与腹膜纤维化进程。

黄芪多糖（Astragaluspolysaccharide，APS）是黄芪的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化等作用，可以减轻大鼠肾组织的炎症反应，改善肾组织纤维化程度[4]，但其具体机制尚不明确。有研究显示，APS 可通过抑制HIF-1α、VEGF表达，减少肺小动脉胶原纤维沉积面积，改善低氧诱导的肺动脉高压小鼠肺血管重构[5]。基于此，本研究考察了APS对PD大鼠腹膜纤维化和血管生成的影响，并基于HIF-1α/VEGF 信号通路研究其作用机制，以期为PD的治疗提供理论依据。

1 材料

1.1 主要仪器

本研究所使用的主要仪器包括TBA-2000FR 型全自动生化分析仪（日本Toshiba 公司）、BX51 型显微镜（日本Olympus公司）等。

1.2 主要药品与试剂

APS对照品（批号R014309-100g，纯度70%）购自上海易恩化学技术有限公司；HIF-1α激动剂二甲基乙二酰氨基乙酸（DMOG，货号HY-15893，纯度99.77%）购自美国MCE公司；PD液（含2.5%葡萄糖）购自广州百特医疗用品有限公司；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（批号20200115）购自北京索莱宝科技有限公司；血清肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）试剂盒（批号分别为YS04392B、YS06475B）均购自上海雅吉生物科技有限公司；Masson 试剂盒（批号HR8326-EIM）购自北京百奥莱博科技有限公司；兔源α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）单克隆抗体（批号19245）购自美国CST公司；兔源HIF-1α、VEGF单克隆抗体（批号分别为sc-13515、sc-7269）均购自美国Santa Cruz 公司；兔源层粘连蛋白（laminin，LN）单克隆抗体（批号LM-0821R）购自上海联迈生物工程有限公司；兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、血小板内皮细胞黏附分子1（又称CD31）单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（H＆L）二抗（批号分别为ab181602、ab182981、ab6702）均购自英国Abcam公司。

1.3 实验动物

SPF级SD雄性大鼠65只，体重200～250 g，购自湖北贝恩特生物科技有限公司，生产许可证号为SCXK（鄂）2021-0027。大鼠饲养环境：温度22～24 ℃，相对湿度50%～60%，正常光照，自由摄食饮水。本研究已获得武汉华联科生物技术有限公司动物伦理委员会审批，伦理批件号为HLK-202203213。

2 方法

2.1 分组、建模与给药

大鼠适应性喂养1 周后，取12 只作为正常对照组（Control组），其他53只进行造模处理：行5/6肾切除术，术后1 周检测Scr 和BUN 水平显著高于正常大鼠后，在大鼠右下腹靠近腹股沟中点处腹腔注射1.5%PD 液100 mL/（kg·d），构建PD大鼠模型，以PD管冲洗通畅判定为PD 造模成功[6]。正常大鼠腹腔注射等体积生理盐水。造模期间，大鼠死亡5只。将48只造模成功的大鼠随机分为模型组（PD 组）、70 mg/kg APS 组（APS-L 组）、140 mg/kg APS 组（APS-H 组）、140 mg/kg APS+40 mg/kg DMOG 组（APS-H+DMOG 组）[7―8]，每组12 只。各给药组大鼠腹腔注射PD液同时灌胃相应剂量的APS及腹腔注射相应剂量的DMOG，Control组和PD 组大鼠灌胃等体积生理盐水。每天给药1次，连续4周。

2.2 腹膜功能检测

各组大鼠末次给药后，腹腔注射4.25%葡萄糖PD液25 mL，取0、4 h大鼠尾静脉血，测定血液中葡萄糖浓度。4 h后麻醉大鼠处死，抽吸腹腔液体计量，再打开腹腔，称量干净纱布质量，再用纱布收集腹腔内未抽净的液体计量。按下式计算大鼠腹膜超滤量（peritoneal ultrafiltration，UF）和葡萄糖转运量（mass transfer of glucose，MTG）：UG＝（纱布吸水后的质量－纱布的质量）×1 mL/g+腹腔抽吸量－腹腔注射量；MTG＝（0 h葡萄糖浓度×PD 液注入体积）－（4 h 葡萄糖浓度×PD 液注入体积）[9]。

2.3 血清中Scr和BUN水平检测

取“2.2”项下麻醉处死前各组大鼠眼眶后静脉丛血，离心后取上清液，按试剂盒说明书方法操作，使用全自动生化分析仪检测血清中Scr和BUN水平。

2.4 腹膜组织病理学观察

每组取6只大鼠的腹膜组织，用4%多聚甲醛固定，制作石蜡切片。石蜡切片行HE 染色，封片后使用显微镜观察各组大鼠腹膜组织病理变化。石蜡切片行Masson 染色，封片后使用光学显微镜观察各组大鼠腹膜组织纤维化变化；每个切片随机选择5个视野计算腹膜厚度及胶原纤维沉积占比。

2.5 腹膜组织微血管密度及α-SMA、LN蛋白表达检测

取“2.4”项下石蜡切片，脱蜡复水后，加入CD31、α-SMA、LN一抗（稀释比例分别为1∶50、1∶1 000、1∶500），4 ℃孵育；随后加入二抗（稀释比例为1∶2 000），室温孵育，行DAB、苏木精染色，漂洗后，干燥封片，使用显微镜观察并采集图片。显微镜下观察CD31的染色情况并计数被染色的阳性微血管数，以5个视野阳性微血管数的均值为微血管密度。使用Image J 软件分析，以光密度值表示α-SMA、LN蛋白的表达水平。

2.6 腹膜组织中HIF-1α/VEGF信号通路相关蛋白检测

取各组剩余6只大鼠的腹膜组织，研磨后离心，取上清液，检测蛋白浓度，煮沸变性，电泳分离，转膜，封闭，加入HIF-1α、VEGF、GAPDH 一抗（稀释比例分别为1∶500、1∶500、1∶1 000），4 ℃孵育；加入二抗（稀释比例为1∶2 000），室温孵育，再加入ECL 共孵育，曝光显影。使用Image J 软件采集图像并分析条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。

2.7 统计学处理

3 结果

3.1 APS对大鼠腹膜UF和MTG的影响

与Control 组比较，PD 组大鼠腹膜UF 显著降低，MTG 显著升高（P＜0.05）；与PD 组比较，APS-L 组、APS-H 组大鼠腹膜UF 均显著升高，MTG 均显著降低（P＜0.05），且APS-H 组改善效果优于APS-L 组（P＜0.05）；与APS-H 组比较，APS-H+DMOG 组大鼠腹膜UF显著降低，MTG显著升高（P＜0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠腹膜UF 和MTG 的检测结果（±s，n＝12）

a：与Control组比较，P＜0.05；b：与PD组比较，P＜0.05；c：与APS-L组比较，P＜0.05；d：与APS-H组比较，P＜0.05。

组别Control组PD组APS-L组APS-H组APS-H+DMOG组UF/mL 16.35±1.85 5.16±0.74a 8.74±0.93b 14.65±1.54bc 10.67±1.16d MTG/（mmoL/kg）11.23±1.20 20.56±2.13a 17.38±1.82b 12.24±1.25bc 16.54±1.71d

3.2 APS对大鼠血清中Scr和BUN水平的影响

与Control 组比较，PD 组大鼠血清中Scr 和BUN 水平均显著升高（P＜0.05）；与PD组比较，APS-L组、APSH组大鼠血清中Scr和BUN水平均显著降低（P＜0.05），且APS-H 组改善效果优于APS-L 组（P＜0.05）；与APSH 组比较，APS-H+DMOG 组大鼠血清中Scr 和BUN 水平均显著升高（P＜0.05）。结果见表2。

表2 各组大鼠血清中Scr和BUN水平的检测结果（±s，n＝12）

表2 各组大鼠血清中Scr和BUN水平的检测结果（±s，n＝12）

a：与Control组比较，P＜0.05；b：与PD组比较，P＜0.05；c：与APS-L组比较，P＜0.05；d：与APS-H组比较，P＜0.05。

组别Control组PD组APS-L组APS-H组APS-H+DMOG组Scr/（μmol/L）30.22±2.76 86.74±7.64a 62.17±5.51b 38.52±3.12bc 55.31±4.83d BUN/（mmol/L）4.32±0.33 9.76±0.89a 7.34±0.63b 5.16±0.46bc 6.45±0.57d

3.3 APS对大鼠腹膜组织病理变化的影响

Control 组大鼠腹膜组织间皮细胞排列整齐、紧密；与Control 组比较，PD 组大鼠腹膜组织结构松散，腹膜间皮细胞脱落，腹膜层及间皮下基质增厚，大量成纤维样细胞及单核、巨噬细胞浸润，纤维素样物质沉积；与PD 组比较，APS-L 组、APS-H 组大鼠只有少部分腹膜间皮细胞排列不整齐并有脱落，腹膜组织腹膜层及间皮下基质增厚减少，细胞浸润减少；与APS-H 组比较，APS-H+DMOG 组大鼠腹膜组织松散，间皮细胞脱落增多，腹膜层及间皮下基质增厚，细胞浸润增多。结果见图1。

→：病变部位。图1 各组大鼠腹膜组织病理形态显微镜图（HE染色）

3.4 APS对大鼠腹膜组织纤维化的影响

与Control 组比较，PD 组大鼠腹膜厚度和胶原纤维沉积占比均显著增加（P＜0.05）；与PD 组比较，APS-L组、APS-H组大鼠腹膜厚度和胶原纤维沉积占比均显著减少（P＜0.05），且APS-H 组改善效果优于APS-L 组（P＜0.05）；与APS-H 组比较，APS-H+DMOG 组大鼠腹膜厚度和胶原纤维沉积占比均显著增加（P＜0.05）。结果见图2和表3。

→：胶原纤维沉积。图2 各组大鼠腹膜组织纤维化显微图（Masson染色）

表3 各组大鼠腹膜厚度、胶原纤维沉积占比的检测结果（±s，n＝6）

表3 各组大鼠腹膜厚度、胶原纤维沉积占比的检测结果（±s，n＝6）

a：与Control组比较，P＜0.05；b：与PD组比较，P＜0.05；c：与APS-L组比较，P＜0.05；d：与APS-H组比较，P＜0.05。

组别Control组PD组APS-L组APS-H组APS-H+DMOG组腹膜厚度/μm 8.67±0.92 36.68±3.27a 28.32±2.33b 16.34±1.49bc 26.17±2.21d胶原纤维沉积占比/%0.17±0.02 0.85±0.09a 0.61±0.06b 0.26±0.03bc 0.52±0.05d

3.5 APS对大鼠腹膜组织微血管密度的影响

与Control 组比较，PD 组大鼠腹膜组织微血管密度显著升高（P＜0.05）；与PD 组比较，APS-L 组、APS-H 组大鼠腹膜组织微血管密度均显著降低（P＜0.05），且APS-H 组改善效果优于APS-L 组（P＜0.05）；与APS-H组比较，APS-H+DMOG 组大鼠腹膜组织微血管密度显著升高（P＜0.05）。结果见图3和表4。

图3 各组大鼠腹膜组织微血管的显微镜图（免疫组化染色）

表4 各组大鼠腹膜组织微血管密度和α-SMA、LN 蛋白表达的检测结果（±s，n＝6）

表4 各组大鼠腹膜组织微血管密度和α-SMA、LN 蛋白表达的检测结果（±s，n＝6）

a：与Control组比较，P＜0.05；b：与PD组比较，P＜0.05；c：与APS-L组比较，P＜0.05；d：与APS-H组比较，P＜0.05。

组别Control组PD组APS-L组APS-H组APS-H+DMOG组微血管密度/（个/视野）0 15.50±7.32a 11.17±5.21b 6.33±3.17bc 13.83±6.19d α-SMA光密度值0.036±0.004 0.089±0.009a 0.066±0.007b 0.043±0.004bc 0.059±0.006d LN光密度值0.021±0.002 0.076±0.008a 0.059±0.006b 0.032±0.003bc 0.047±0.005d

3.6 APS 对大鼠腹膜组织中α-SMA、LN 蛋白表达的影响

与Control 组比较，PD 组大鼠腹膜组织中α-SMA、LN蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与PD组比较，APS-L组、APS-H组大鼠腹膜组织中α-SMA、LN蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），且APS-H 组改善效果优于APS-L 组（P＜0.05）；与APS-H 组比较，APS-H+DMOG 组大鼠腹膜组织中α-SMA、LN 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。结果见图4和表4。

3.7 APS 对大鼠腹膜组织中HIF-11α/VEGF 信号通路相关蛋白表达的影响

与Control 组比较，PD 组大鼠腹膜组织中HIF-1α、VEGF 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）；与PD 组比较，APS-L 组、APS-H 组大鼠腹膜组织中HIF-1α、VEGF蛋白表达水平均显著降低（P＜0.05），且APS-H 组改善效果优于APS-L 组（P＜0.05）；与APS-H 组比较，APSH+DMOG 组大鼠腹膜组织中HIF-1α、VEGF 蛋白表达水平均显著升高（P＜0.05）。结果见图5和表5。

图5 各组大鼠腹膜组织中HIF-11α、VEGF 蛋白表达的电泳图

表5 各组大鼠腹膜组织中HIF-11α、VEGF 蛋白表达的检测结果（±s，n＝6）

表5 各组大鼠腹膜组织中HIF-11α、VEGF 蛋白表达的检测结果（±s，n＝6）

a：与Control组比较，P＜0.05；b：与PD组比较，P＜0.05；c：与APS-L组比较，P＜0.05；d：与APS-H组比较，P＜0.05。

组别Control组PD组APS-L组APS-H组APS-H+DMOG组HIF-1α 0.48±0.06 0.89±0.04a 0.73±0.05b 0.52±0.02bc 0.66±0.03d VEGF 0.53±0.03 0.96±0.03a 0.78±0.06b 0.57±0.06bc 0.71±0.07d

4 讨论

PD主要是利用腹膜生物半透膜特性清除体内代谢产物和超滤水分，维持电解质和酸碱平衡。长期使用PD 液特别是含有高浓度葡萄糖的PD 液可使腹膜的结构和功能发生改变，导致透析效能降低、超滤失败。本研究结果显示，APS 可以增加PD 大鼠腹膜UF，减少MTG 和血清中Scr、BUN 水平，从而抑制腹膜纤维化及血管新生。

腹膜纤维化是导致超滤衰竭的主要原因之一，而腹膜结构基础的间皮细胞是影响腹膜纤维化的关键。研究显示，α-SMA 表达增加可以导致腹膜纤维化发生，抑制腹膜间皮分泌α-SMA 可以延缓腹膜间皮细胞转分化，从而防治腹膜纤维化[10]。LN为细胞外基质的主要成分，也是胶原形成过程的中间产物，参与体内纤维化进程，其水平也可以间接反映体内纤维化的程度。研究显示，降低LN 蛋白表达水平可以阻止肾间质成纤维细胞的激活，抑制肾纤维化的发生[11]。本研究结果显示，APS可以下调α-SMA、LN蛋白表达，从而防治腹膜纤维化。

血管新生是在原有血管基础上出芽、套叠增生而成，参与机体的生长发育、组织修复、肿瘤形成等生理病理进程。新生的腹膜血管可以增大腹膜毛细血管的交换面积，加速腹膜吸收葡萄糖的速度，导致腹腔渗透浓度梯度消失加快、腹膜超滤减少，致使体内的水分及尿液中毒素物质不能及时清除，严重时可能造成心脏超负荷，甚至危及生命[12]。HIF-1α 是血管生成的启动因子，可以诱导血管生成；VEGF是内皮细胞特异性生长因子，可以诱导内皮细胞增殖、分化与迁移，修复损伤，促使血管新生，保持血管壁通透性与完整性等，是血管新生的标志性指标；另外VEGF是HIF-1α 主要靶基因之一，在缺氧条件下，可被HIF-1α 迅速诱导活化。研究显示，下调VEGF 的表达可以抑制大鼠肾脏病理性血管新生从而减轻纤维化损伤[13]；抑制HIF-1α/VEGF信号通路可以降低关节炎大鼠炎症水平，抑制相关蛋白的表达，减缓血管的扩张及新生[14]。本研究结果显示，APS 可以抑制HIF-1α、VEGF蛋白表达，从而抑制腹膜血管新生及腹膜纤维化；而作为HIF-1α 激动剂的DMOG 可以逆转APS对腹膜血管新生及腹膜纤维化的抑制作用。

综上所述，APS可以通过抑制HIF-1α/VEGF信号通路来抑制PD大鼠腹膜纤维化及血管新生。