基于质量源于设计（QbD）制备大黄素固体脂质纳米粒

李 楠，邓艳平

福建医科大学药学院，福建 福州 350122

纳米制剂的发展将带来更多创新或个性化的疗法，为攻克更多重大疾病带来希望[1]。基于此，常用纳米制剂如脂质体[2-3]、胶束[4-5]、固体脂质纳米粒（solid lipid nanoparticle，SLN）[6-7]等已经得到广泛的应用。但纳米制剂的安全性、工艺及质量的可控性、关键设备及辅料对国外的过度依赖性等问题仍是需要应对的挑战[8]。

传统制剂的开发基于质量的检测和生产出发，而引入质量源于设计（quality by design，QbD）理念，改进制造过程，可确保最终产品的质量和安全。QbD 已经广泛应用于美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）和欧洲药物管理局（European Medicines Agency，EMA）。QbD的基本内容（图1）是：以预先设定的目标产品质量概况（quality target product profile，QTPP）作为研发的起点，在确定产品关键质量属性（critical quality attributes，CQAs）的基础上，基于风险评估和实验研究，确定关键物料属性（critical material attributes，CMAs）和关键工艺参数（critical process parameters，CPPs），进而建立能满足产品性能且工艺稳健的控制策略，最终完成设计、完善整体战略方案，实施产品和工艺的生命周期管理（包括持续改进）。QbD 原则[9-10]在近年来成功应用于开发纳米制剂递药系统如脂肪乳[11]、纳米粒[12]。

图1 QbD 理念在处方工艺优化中的实施过程Fig.1 Implementation of QbD concept in prescription process optimization

因多酚类药物具有良好抗氧化、肿瘤预防作用，但大部分具有水溶性低、肠道壁通透性差、胃肠道代谢等缺点，阻碍了该类药物研发成口服制剂的发展进程[13]。而大黄素属于典型的多酚类药物，故本实验以大黄素为模型药物，利用QbD 开发大黄素固体脂质纳米粒（emodin solid lipid nanoparticle，Emo-SLN）。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1260 型高效液相色谱仪，安捷伦科技（中国）有限公司；DF-101S 型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；ME104 E型电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Centrifuge 5430 R 型离心机，德国艾本德生命科学公司；ZQTY 50 型震荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；Sonics 型超声细胞破碎仪，上海书俊仪器设备有限公司；Anton Paar LitesizerTM500 型激光纳米粒度/电位仪，安东帕（上海）商贸有限公司。

1.2 样品与试剂

单辛酸丙二醇酯（CapryolTM90，批号85883-73-4）、油酰聚氧乙烯甘油酯（Labrafil M 1944 CS，批号192796）、单月桂酸丙二醇酯（LauroglycolTM90，批号127903）、单亚油酸甘油酯（MaisineTM，批号125116）、山嵛酸甘油酯（Compritol 888 ATO，批号156632）、单双硬脂酸甘油酯（批号143048）、双硬脂酸甘油酯（Percirol ATO 5，批号131343）、硬脂酰聚氧乙烯甘油酯（Gelucire 50/13，批号121651）、月桂酰聚氧乙烯-32 甘油酯（Gelucire 44/14，批号125008）、二乙二醇单乙醚（Transcutol®HP，批号145272）均为法国Gattefossé 公司惠赠；聚乙二醇400（PEG 400，批号20101214）、聚山梨酯20（Tween 20，批号20200303）、聚山梨酯80（Tween 80，批号20100502）均为南京威尔集团有限公司所产；曲拉通X-100（Triton X-100，批号20131918）由国药集团化学试剂有限公司所产；中链甘油三酯（MCT，批号 19985）、丙二醇二辛酸酯（propylene dioctanoate，批号131202）、三乙酸甘油酯（triacetin，批号Z16J7Y9191）均由北京凤礼精求商贸有限责任公司所产；聚乙二醇-15 羟基硬脂酸酯（Solutol®HS15，批号96146968E0）、聚氧乙烯氢化蓖麻油（Cremophor®RH40，批号16894024UO）均为德国BASF 公司惠赠。大黄素对照品，批号518-82-1，质量分数≥98%，购于上海麦克林生化科技股份有限公司；甲醇为色谱纯试剂，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 Emo-SLN 的QbD 评价

2.1.1 QTPP 大黄素对光敏感、易氧化分解，为使用和贮存带来不便；且由于大黄素难溶于水，且存在胃肠道代谢，以口服给药为途径，将其制成SLN，可提高其溶解度，使药物稳定性增加，提高药物在人体的生物利用度的同时还可减少药物剂量，提高患者用药依从性。为改善大黄素难溶和不稳定等一系列问题，以安全、稳定且有效的口服SLN 为目标产品，通过查阅文献，结合临床用药的特点，总结上述目标产品的质量概况，结果如表1 所示。

表1 Emo-SLN 的QTPPTable 1 QTPP for Emo-SLN

2.1.2 CQAs CQAs 是“物理、化学、生物学或微生物学性质或特点，应在适宜的限度、范围或分布内以保证预期药品的质量”[17]。根据大黄素的性质和鱼骨图法[18]，得表2 及图2 中的CQAs 包含的粒径、包封率、载药量、体外释放等参数。

表2 Emo-SLN 的CQAsTable 2 CQAs of Emo-SLN

图2 Emo-SLN 的鱼骨图Fig.2 Fish bone diagram of Emo-SLN

2.1.3 制剂的风险评估 根据Emo-SLN 的CQAs，对制剂进行风险评估[19]，以评估每种属性可能对制剂CQAs 的影响。使用故障模式、影响和危害性分析（failure mode and effects criticality analysis，FMECA）方法（表3、4）进行评估[20]。

表3 FMECA 法进行风险评估Table 3 FMECA methods for risk assessment

表4 FMECA 法的风险优先系数 (RPN) 评价标准Table 4 FMECA methods for risk priority number (RPN)evaluation criterion

SLN 主要由原料药、脂质、表面活性剂（乳化剂）、助表面活性剂（助乳化剂）和水组成。脂质主要作为SLN 的载体，可提高大黄素的溶解度，影响SLN 的安全性和稳定性。表面活性剂作为SLN 中的重要成分，可降低界面势能，与其稳定性和安全性高度相关。根据相关文献及制剂经验，采用FMECA 法对Emo-SLN 的处方变量包括：原料药、表面活性剂、脂质和助表面活性剂进行风险评估。结果如表5 所示。采用熔融乳化法制备SLN，其中，相转变温度、超声功率、超声时间是影响该制剂SLN 制备的关键因素。对其进行风险评估（表6），并对SLN 进行QbD 评价（图3）。

表5 处方变量的风险评估Table 5 Risk assessment of formulations

表6 工艺变量的风险评估Table 6 Risk assessment of processes

图3 SLN 的QbD 评价图Fig.3 Diagram of QbD evaluation for SLN

2.2 Emo-SLN 的CMAs 筛选

分别于相应的脂质、表面活性剂、助表面活性剂中加入过量大黄素，置于恒温摇床避光振摇24 h后取出，于37 ℃、10 000 r/min 离心（离心半径为10 cm）15 min。取上清液，用0.45 μm 滤膜滤过后进样HPLC 分析，计算大黄素的溶解度。结果如表7、8 所示，选择CapryolTM90 为脂质，Cremophor®RH40 作为表面活性剂。

表7 大黄素在脂质中的溶解度Table 7 Solubility of emodin in lipids

表8 大黄素在表面活性剂中的溶解度Table 8 Solubility of emodin in emulsifiers

2.3 Emo-SLN 的制备

以50 ℃为制备温度，选用熔融乳化法，于50℃分别加水及处方量的大黄素与脂质CapryolTM90（质量比1∶160）、表面活性剂Cremophor®RH40、助表面活性剂Transcutol®HP 混匀，搅拌3 min，于超声细胞破碎仪（功率200 W，超声时间5 min，工作2 s，暂停2 s）破碎，2～8 ℃保存12 h 后过0.8 μm 的滤膜，即得Emo-SLN。

2.4 SLN 的质量控制研究

2.4.1 含量测定 选用HPLC 法[24]进行测定，色谱条件如下：色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为水-甲醇（10∶90）；体积流量1.0 mL/min；检测波长265 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。

精密称取1 mg 大黄素，溶解于甲醇溶液中，作为大黄素对照品溶液。并按“2.3”项下的方法制备空白SLN（除了不加大黄素其余步骤同上）。取适量的空白SLN 按其与甲醇体积比（1∶9）的比例下加入甲醇，涡旋破乳后，以流动相稀释；同法操作，进样稀释后的Emo-SLN 和大黄素对照品溶液，对比3 个样品的出峰时间，判断辅料是否会对样品产生干扰，以及制得的Emo-SLN 检测到的色谱峰是否为大黄素的样品峰。如图4 所示，表明溶剂和辅料在该色谱条件下对药物大黄素的测定没有干扰，结果表明药物大黄素测定的专属性良好。在100～2 500 μg/mL 呈良好的线性关系；精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验均符合要求。

图4 Emo-SLN (A)、大黄素对照品 (B) 和空白SLN (C) 的HPLC 图Fig.4 HPLC of Emo-SLN (A), emodin reference substance(B) and blank SLN (C)

2.4.2 Emo-SLN 的形态、粒径和ζ 电位 吸取5 μL Emo-SLN 溶液滴到铜网上，静置1 h，滴加2%的磷钨酸至铜网表面，负染1～2 min，室温自然晾干。置于TEM 下，逐渐放大至30 000 倍，观察其形态。所制SLN 用超纯水稀释100 倍后，用激光纳米粒度仪测定其粒径、ζ 电位和多分散系数（polydispersity index，PDI）。

2.4.3 包封率和载药量测定 取一定量体积Emo-SLN 溶液，按其与甲醇体积比（1∶9）的比例加入甲醇进行破乳，用0.45 μm 微孔滤膜滤过，在“2.4.1”项下色谱条件进样检测，即可测得W总。再另取1 mL Emo-SLN 溶液于30 000×g、4 ℃下高速离心（离心半径为10 cm）1 h，取上层乳液，同法测定，即得W游离。按如下公式计算包封率和载药量。

包封率＝W游离/W总

载药量＝(W总－W游离)/(W总－W游离＋W脂质)

W游离、W总、W脂质分别为Emo-SLN 的未包载药物量、总药物含量和SLN 内除了大黄素以外的所有脂质辅料的质量

2.4.4 稳定性考察 将Emo-SLN 置于2～8 ℃冰箱，于不同时间（0、7、21、32 d）取样检测其粒径和PDI。

2.4.5 安全性考察 以体外溶血实验考察Emo-SLN 的安全性。选用《中国药典》2020 年版中的方法测定[25]，取健康家兔的新鲜血液，1 000 r/min 离心（离心半径为10 cm）10 min，弃去上清液。将所得红细胞用生理盐水配成2.0%的混悬液备用；取300 μL 的30、50、70 μmol/L Emo-SLN 溶液加入2.5 mL 该红细胞悬液后再加入2.2 mL 生理盐水，均匀混合后，放入37 ℃恒温水浴孵育60 min，后1 800 r/min 离心（离心半径为10 cm）10 min。取上清，用紫外分光光度计测定波长540 nm 下的吸光度（A）值。以生理盐水为空白对照组，以超纯水为阳性对照组，每组设3 个平行复孔。按照下列公式计算溶血率。

溶血率＝(A实验－A生理盐水)/(A蒸馏水－A生理盐水)

2.4.6 体外释放实验 采用透析袋法[26]进行体外释放测定。分别取1 mg/mL Emo-SLN 溶液及大黄素溶液1 mL，以200 mL 0.05 g/mL 十二烷基硫酸钠（SDS）为溶出介质[27]，温度为37 ℃，转速为8 r/min，分别于0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、7.0、19.0、24.0 h 取样1 mL，同时补充超纯水1 mL，样品处理后以HPLC 进行测定。

2.5 Emo-SLN 的处方优化试验设计

2.5.1 处方优化试验设计 通过文献报道[26-29]，综合考虑上述列出的CMA、CPP，选择以药脂比（1∶X1）、表面活性剂用量（X2）、超声功率（X3）为自变量，并以SLN 的粒径（Y1）、PDI（Y2）和包封率（Y3）为评价指标，基于单因素实验结果，确定3个自变量的设计范围：药脂比（X1160～300）、表面活性剂用量（X23%～5%）和超声功率（X3200～300 W）。根据Box-Behnken 设计（BBD）响应面原理[30]，本实验采用3 因素5 水平的星点设计，并根据响应面试验进行优化分析。操作步骤同“2.3”项。试验设计及结果见表9～12。可得出粒径的回归方程为Y1＝286.49－39 913.53X1＋11.43X2＋0.19X3，R2＝0.702 3，Radj2＝0.633 6，Rpred2＝0.456 0；PDI 的回归方程为Y2＝140.00－19 834.48X1－31.24X2－0.17X3－2 876.71X1X2＋58.12X1X3－0.05X2X3＋1.70X12＋6.81X22＋2.80×10−4X32，R2＝0.853 7，Radj2＝0.665 5，Rpred2＝0.488 0；模型相关系数R2分别为0.702 3、0.853 7，这说明该试验模型与实际试验拟合较好，实际试验中约70.23%、85.37%的结果可以通过拟合模型进行解释。校正后的决定系数R2adj分别为0.633 6、0.665 5，与R2相对接近，说明2 模型均有较好的准确性和通用性。

表9 响应面实验设计及结果Table 9 Design and results of response surface method

而包封率的回归方程为Y3＝−59.09＋156.46X1＋25.31X2＋0.52X3－4.16X1X2－0.45X1X3－0.10X2X3，R2＝0.5750，Radj2＝0.320 0，Rpred2＝0.108 2；该试验模型与实际试验拟合一般，且数据间无显著性差异，故后续以PDI 为主，判断不同因素对其影响。由表10 可以看出，对于粒径影响的因素顺序为药脂比＞表面活性剂＞超声功率；由表11 可以看出，对于PDI 影响的因素顺序为表面活性剂＞超声功率＞药脂比。两模型的P值均＜0.05，响应面回归模型达到了显著性水平。

表10 粒径 (Y1) 的回归模型方差分析Table 10 Variance analysis of established regression model for particle size (Y1)

表11 PDI (Y2) 的回归模型方差分析Table 11 Variance analysis of established regression model for PDI (Y2)

表12 包封率 (Y3) 的回归模型方差分析Table 12 Variance analysis of established regression model for encapsulation efficiency (Y3)

2.5.2 Box-Behnken 响应面交互作用 在回归模型方差分析结果的基础上，采用Design-Expert 13 软件依据Y1、Y2，在回归模型方差分析结果的基础上绘制响应面图及等高线图，分析药脂比、表面活性剂用量和超声功率对Emo-SLN 中大黄素粒径、PDI的影响（图5）；3D 响应曲面和等高线图可直观反映交互作用对响应值的影响程度，曲面越陡，等高线越密集，则影响越显著，等高线越接近椭圆，2个因素的交互作用越强[31]。

图5 药脂比、表面活性剂用量、超声功率对PDI 交互影响的响应面图和等高线图Fig.5 Response surface diagram and contour plots illustrating interaction effects of drug-lipid ratio, surfactant concentration and ultrasonic power on PDI

药脂比与超声功率对PDI 的影响最大，药脂比与表面活性剂对其影响次之，表面活性剂与超声功率对其影响最小（图5）。在药脂比较低的情况下，随着表面活性剂比例的增加，PDI 先减少后增加（图5）；当药脂比在较高水平时，反之，响应面的倾斜度较高，坡度较为陡峭，且等高线呈椭圆形，说明药脂比和表面活性剂的交互作用对PDI 的影响较大；同理，说明超声功率和表面活性剂的交互作用对PDI 的影响较小（图5）；药脂比和超声功率的交互作用对PDI 的影响较大（图5）。

2.6 Emo-SLN 的制备工艺验证

根据“2.5”项设计所得的最优条件进行实验：药脂比为1∶170，表面活性剂比例为4.13%，超声功率为216.14 W，据此平行制备3 批Emo-SLN，对该处方设计进行验证，将测定的粒径、PDI与“2.5”项预期结果进行比较（表13）。由表13 可知，预测值与实测值间的偏差均小于1，二者较为接近，说明该模型较为可靠。综上，选择药脂比为1∶170，表面活性剂用量为4%，超声功率为216 W 为最优处方，该处方的包封率为（98.28±1.43）%，载药量为（0.23±0.01）%。实验发现制备的Emo-SLN为球形，无黏连，大小均一，且粒径在100～200 nm，ζ 电位（−21.90±0.50）mV（图6～8），分散性良好（PDI 小于0.3），符合CQAs 要求。

表13 预测值与实际值的比较 (±s, n = 3)Table 13 Comparison of predictive value and actual value(±s, n = 3)

表13 预测值与实际值的比较 (±s, n = 3)Table 13 Comparison of predictive value and actual value(±s, n = 3)

优化指标 Y1/nm Y2预测值 145.90 4.10实测值 146.89±3.41 5.65±1.05偏差 0.50 0.77

图6 Emo-SLN 的粒径分布图Fig.6 Particle size distribution of Emo-SLN

图7 Emo-SLN 的电位分布图Fig.7 Potential distribution of Emo-SLN

图8 Emo-SLN 的透射电镜图Fig.8 TEM image of Emo-SLN

根据上述最佳条件制备的Emo-SLN在2～8 ℃储存32 d 内，其粒径（RSD 均小于1.5%）和分散系数（RSD 均小于0.01%）变化微小（表14），说明其具有良好稳定性。

表14 Emo-SLN 的稳定性 (2～8 ℃,±s, n = 3)Table 14 Stability of Emo-SLN at (2—8 ℃,±s, n = 3)

t/d 粒径/nm PDI 0 138.90±1.14 0.063±0.006 7 108.63±1.38 0.152±0.005 14 143.87±0.25 0.087±0.007 21 127.77±0.46 0.238±0.006 32 136.30±0.28 0.086±0.003

Emo-SLN 的溶血性实验结果如表15 和图9 所示，其在30～70 μmol/L 浓度范围内无溶血现象（溶血率测定结果均小于5%），从而证明其不会引起体外红细胞溶血。

表15 Emo-SLN 的体外溶血率 (±s, n = 3)Table 15 In vitro hemolytic rate of Emo-SLN (±s, n = 3)

表15 Emo-SLN 的体外溶血率 (±s, n = 3)Table 15 In vitro hemolytic rate of Emo-SLN (±s, n = 3)

组别 浓度/(μmol∙L−1) 溶血率/%水 − 100生理盐水 − 0 Emo-SLN 30 −0.660±0.085 50 2.027±0.439 70 3.864±0.455

图9 Emo-SLN 与红细胞、水、生理盐水孵育后的图片Fig.9 Picture of Emo-SLN at different concentrations incubated with red blood cells, water and saline

大黄素原料药与Emo-SLN 体外释放结果如图10 所示，相对原料药，Emo-SLN 的释放仅有30%左右（7 h），说明Emo-SLN 具有缓释的作用。对其进行动力学方程拟合，结果如表16 所示，发现其体外释药行为符合一级线性方程，Qt＝80.003 (1－e−0.084t)，R2＝0.988 3。

表16 Emo-SLN 的药物释放模型Table 16 Drug release kinetic models of Emo-SLN

图10 Emo-SLN 和大黄素溶液的体外释放情况 (±s,n = 3)Fig.10 In vitro release profiles of Emo-SLN and free emodin (±s, n = 3)

3 讨论

根据国家药品监督管理局发布的国家药品标准关于大黄配方颗粒[32]，1 g 含总蒽醌以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的总量计，应为10.0～25.0 mg。可见目前使用的处方中大黄素含量较低，且给药剂量大，故已上市并在临床上长期使用的大黄素制剂几乎没有。开发一个可供临床使用的大黄素纳米制剂迫在眉睫。

2021 年国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）发布的《纳米药物质量制研究技术指导原则（试行）》中也有引入QbD 的概念，且在该指导原则中提及纳米药物应重点关注可能与体内行为相关的质量指标，如粒径、药物释放度以及与其特性相关的性能指标，如结构形态、包封率、载药量、纳米粒稳定性等，同时也需对纳米药物进行全过程质量控制，包括纳米药物用到的原料药、辅料、制备的工艺参数等[33]。

故本研究引入QbD 理念对该Emo-SLN 工艺进行全面且深入的分析。首先，确认Emo-SLN 的质量概况，采用鱼骨图法和查阅文献，确定其CQAs（粒径、包封率、载药量、体外释放），再采用风险管理工具筛选出影响其质量的潜在CMAs（脂质、表面活性剂、助表面活性剂、脂质与药物质量比）。

实验发现大黄素在脂质材料CapryolTM90，表面活性剂Solutol®HS 15 中的溶解度比较好，且熔点较低。但因Solutol®HS 15 是一种亲水性极强的辅料［亲水亲油平衡值（HLB）为14～16］，CapryolTM90 为水不溶性的脂质（HLB 值为5），二者无法均匀地混合，混合后静置即会分层，所以本实验采用溶解度次之的Cremophor®RH40作为表面活性剂材料，其他皆选用上述药物在其溶解度最大的材料。经查阅文献[34]，发现，助表面活性剂Transcutol®HP的溶解度大于PEG 400，所以选择Transcutol®HP作为助表面活性剂。选用的脂质CapryolTM90[35]可能增加脂质和蛋白质区域的肠脂膜流动性，从而通过跨细胞途径促进肠道对胰岛素的吸收，且CapryolTM90 是一种生物利用度增强剂，因此，此脂质有望促进大黄素在肠道的吸收，增强其在肠道的生物利用度。且有文献报道[36]Cremophor®RH40有可能影响经细胞色素CYP3A4 转化的药物代谢及处置，增加药物的生物利用度，对药物的临床应用产生显著影响；以Cremophor®RH40 为辅料的大黄素纳米乳通过减少在MDCK II 细胞高表达的葡萄糖醛酸转移酶醛酸化而增加跨细胞渗透，可作为提高大黄素口服生物利用度的一种有前途的策略[37]。Cremophor®RH40 的这一特点可针对大黄素存在的首关消除效应，从而提高大黄素在体内的生物利用度。且Cremophor®RH40 与CapryolTM90 合用，一方面有望提高大黄素在肠道的吸收，另一方面又可降低大黄素在肠道的代谢。

Emo-SLN 中大黄素的溶解度为大黄素溶液的近10 倍，显著地提高了药物的溶解度。基于QbD设计，并筛选了CMAs 及CPPs，17 组样品测得的包封率均大于80%，较其他Emo-SLN 的包封率提高了25%左右[38]，PDI 小于0.5，表面活性剂比例较其他的大黄素纳米制剂小[23]，可减少表面活性剂的毒性，安全性更大，以上结果均符合CQAs 的要求。本实验以QbD 为理论基础，成功设计Emo-SLN的开发，并为SLN 及其他纳米药物的开发研究提供了思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突