基于指纹图谱和含量测定评价地黄不同入药形式制千金黄连丸质量

张春亚，张 威，李莹莹，雷敬卫*，杨颜溶，田瀚举，张 娟，赵新梅，段浩瀚，龚海燕，杨春静，王笑笑

1.河南中医药大学，河南 郑州 450046

2.郑州卫生健康职业学院，河南 郑州 450122

3.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450046

千金黄连丸（Qianjin Huanglian Pills，QHP）出自药王孙思邈《备急千金要方》，又名黄连丸，方中黄连为君，地黄为臣，相须配伍，具有养阴清热、生津止渴的功效。临床上主要用于治疗阴虚热盛型消渴病。书中写到“黄连一斤，生地黄一斤（张文仲云十斤）。右二味，绞地黄汁，浸黄连，出曝之燥，复纳之，令汁尽干之，捣末”[1]。此处“生地黄”即现代意义上的鲜地黄，由此可知原方是鲜地黄绞汁入药，然而因地黄汁的制备及存放问题，临床多使用生地黄与黄连配伍。临床上对于古方QHP 的使用出现变化，而对于其古今不同制法的成分分析研究较少，因此，需要进一步展开研究，阐明中医遣方用药的科学内涵。目前，道地产区将鲜地黄快速烘干，得另一种鲜地黄形式鲜干地黄片，保留了鲜地黄中的大量化学成分且便于储存，基于此本研究创新性地将鲜干地黄片用于制备QHP。

地黄主要含有糖类、环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类成分[2-4]，以梓醇为代表的环烯醚萜苷类成分具有抗氧化、保肝降糖等多种药理作用[5-7]，以水苏糖为代表的地黄寡糖也是地黄活性组分[8-9]，具有降低糖尿病大鼠血糖及调节肠道菌群功能[10]。黄连主要含有异喹啉类生物碱、木脂素、香豆素、黄酮等化学成分，具有降血糖、抗菌、抗氧化等药理作用[11-12]。地黄中的寡糖类、苷类成分[13-14]，黄连中的生物碱类成分[15-16]，可能是发挥用于治疗糖尿病药理作用的物质基础。

因此，本实验分别使用鲜地黄汁、鲜干地黄片、生地黄制备QHP，得鲜地黄连丸（Xiandi Huanglian Pills，XD）、鲜干黄连丸（Xiangan Huanglian Pills，XG）、生地黄连丸（Shengdi Huanglian Pills，SD），在此基础上建立QHP 的HPLC 指纹图谱和环烯醚萜苷类、黄连碱类、糖类成分的含量测定方法，并利用化学计量学分析比较地黄不同入药形式制QHP 中化学成分的差异，为完善QHP 质量标准提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1200 型高效液相色谱仪，美国Agilent公司；Waters 2695-2998 型高效液相色谱仪，美国Waters 公司；Alltech 2000ES 型蒸发光检测器，美国奥泰科技（中国）有限公司；Venusil XBP C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，天津博纳艾杰尔科技有限公司；Agilent Zorbax NH2色谱柱，安捷伦科技（中国）有限公司；101-3AB 型电热鼓风干燥箱，北京中兴伟业仪器有限公司；HQ-700DE 型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DZKW-4型电子恒温水浴锅，北京中兴伟业仪器有限公司；四号药典筛，浙江上虞市五四仪器筛具厂；BSA224S-CW 型万分之一天平、CPA225D 型十万分之一电子天平，赛多利斯科学仪器北京有限公司；FW-100 型高速多功能粉碎机，北京科伟永兴仪器有限公司。

1.2 试药

对照品益母草苷（批号MUST-21121010，质量分数≥98.69%）、桃叶珊瑚苷（批号MUST-21100811，质量分数≥99.10%）、梓醇（批号MUST-21041120，质量分数≥99.56%）、地黄苷 D（批号 MUST-20101311，质量分数≥98.15%）均购自成都曼斯特生物科技有限公司；对照品地黄苷 A（批号wkq20032402，质量分数≥98%）、毛蕊花糖苷（批号wkq17042401，质量分数≥98%）购自四川省维克奇生物科技有限公司；对照品D-无水葡萄糖（批号Y19F11J108781，质量分数≥98%）、水苏糖（批号J04D10R104841，质量分数≥98%）购自上海源叶生物科技有限公司；对照品果糖（批号AF21021653，质量分数≥98%）、蔗糖（批号AF20110803，质量分数≥98%）、棉子糖（批号AF21081854，质量分数≥98%）均购自成都埃法生物科技有限公司；甲醇，色谱纯，美国Tedia 公司；无水乙醇，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；甲醇均为分析纯；娃哈哈水。

1.3 药材

本研究所用黄连饮片购自安徽德昌药业股份有限公司，产地为四川彭州；地黄样品于2022 年12月采自河南省焦作市；经河南中医药大学陈随清教授鉴定，黄连为毛莨科黄连属植物黄连Coptis chinensisFranch.的干燥根茎，地黄为玄参科地黄属植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的新鲜根茎。

2 方法与结果

2.1 XD、XG、SD 的制备

分别以鲜地黄汁、鲜干地黄汤剂、生地黄汤剂与黄连粗粉混匀制备XD、XG、SD。QHP 样品制备方法如下，样品信息见表1。

2.1.1 XD 取鲜地黄500 g，经原汁机榨汁、滤网滤过得鲜地黄汁250 mL；取黄连粗粉50 g 至托盘中，少量多次加入全部鲜地黄汁，混匀后50 ℃低温烘干，打粉，过4 号药典筛，干粉保存于干燥器中[17]。

2.1.2 XG 取鲜地黄500 g（含水量80%），洗净，切片，置70 ℃烘箱，干燥24 h，得100 g 鲜干地黄片。取100 g 鲜干地黄片，一煎加7 倍量水，浸泡30 min，从沸腾开始计时文火（300 W）煎煮30 min；二煎加6 倍量水，从沸腾后开始计时，转文火（300 W）煎煮20 min[18]。合并2 次煎煮液，调整体积至500 mL，得鲜干地黄汤剂。取鲜干地黄汤剂500 mL，50 ℃水浴调整体积至250 mL，取黄连粗粉50 g 至托盘中，少量多次加入鲜干地黄汤剂，混匀后50 ℃低温烘干[17]，过4 号药典筛，干粉保存于干燥器中。

2.1.3 SD 参照《中国药典》2020 年版“地黄”项下“生地黄”要求，将500 g 鲜地黄置烘箱50 ℃烘48 h，后升温至70 ℃继续烘至无硬心，再将温度降至40 ℃烘至地黄表面发硬，取出，用麻袋盖严发汗，使内部水分往外渗出至表里干湿一致，后40 ℃干燥至地黄全身发软，手握表面发硬，取出，放凉[19]，得生地黄药材，得率为20%。切厚片，得生地黄饮片。取100 g 生地黄片，一煎加7 倍量水，浸泡30 min，从沸腾开始计时文火（300 W）煎煮30 min；二煎加6 倍量水，从沸腾后开始计时，转文火（300 W）煎煮20 min[18]。合并2 次煎煮液，调整体积至500 mL 得生地黄汤剂。取生地黄汤剂500 mL，50 ℃水浴调整体积至250 mL，取黄连粗粉50 g 至托盘中，少量多次加入生地黄汤剂，混匀后50 ℃低温烘干[17]，过4 号药典筛，干粉保存于干燥器中。

2.2 XD、XG、SD 的指纹图谱研究

2.2.1 色谱条件 色谱柱为Venusil XBP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-0.02 mol/L 磷酸二氢钾水溶液，梯度洗脱：0～8 min，5%～10%甲醇；8～30 min，10%～24%甲醇；30～50 min，24%～32%甲醇；50～60 min，32%甲醇；60～70 min，32%～34%甲醇；70～80min，34%～38%甲醇；体积流量0.8 mL/min；柱温35 ℃；PDA 检测器检测波长：0～25 min，203 nm；25～80 min，280 nm；进样量5 µL。

2.2.2 对照品溶液的制备 取梓醇、益母草苷、黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马丁对照品适量，精密称定，置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到质量浓度分别为3.020、0.520、0.535、0.570、0.510、4.500、1.030 mg/mL 的混合对照品溶液，备用。

2.2.3 供试品溶液的制备 取各黄连丸样品约0.5 g，精密称定，置100 mL 具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，称定质量，超声（700 W、40 kHz）处理30 min，放冷，再称定质量，用80%甲醇补足减失的质量，滤过，取2 mL，经0.22 μm 的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液，备用。

2.2.4 精密度试验 取同一供试品溶液（XD1 样品），按照“2.1.1”项下色谱条件连续进样6 次，以小檗碱为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD 为0～1.72%，相对峰面积的RSD 为0～2.08%，结果表明仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验 取同一供试品溶液（XD1 样品），分别在制备后0、2、4、8、12、24 h 按照“2.1.1”项下色谱条件进样测定，以小檗碱为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD 为0～1.32%，相对峰面积的RSD 为0～2.11%，结果表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.2.6 重复性试验 取XD1 样品6 份，按“2.1.3”项下方法平行制备供试品溶液，按照“2.1.1”项下色谱条件进样，以小檗碱为参照峰，计算得到各共有峰的相对保留时间的RSD 为0～1.56%，相对峰面积的RSD 为0～2.34%，结果表明该方法重复性较好。

2.2.7 相似度评价 按照“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，并按照“2.1.1”项下色谱条件进样测定，采集混合对照品溶液、XD、XG 及SD 样品的HPLC图，结果见图1、2。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》（2012A 版）软件进行评价，以XD1样品图谱为参照图谱，时间窗为0.1 min，采用中位数法进行相似度评价，相似度评价结果见表2。

图1 30 批QHP 样品的HPLC 图及其对照指纹图谱 (R)Fig.1 HPLC fingerprint of 30 batches of QHP and its reference fingerprint (R)

表2 30 批QHP 相似度评价Table 2 Similarity evaluation of 30 batches of QHP

结果表明，样品间具有较高相似度。经多点校正和Mark 峰匹配后生成对照指纹图谱，共标定19个共有峰，通过与对照品对比，分别为梓醇（2 号峰）、益母草苷（7 号峰）、黄连碱（14 号峰）、表小檗碱（15 号峰）、药根碱（17 号峰）、小檗碱（18 号峰）、巴马丁（19 号峰）。其中，已指认的2 个环烯醚萜苷类成分梓醇和益母草苷来自地黄，黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马丁来自黄连。

对HPLC 图进行差异分析，如图2 所示，可知不同入药形式制QHP 的HPLC 色谱图峰数目无明显区别，而XD 及XG 中峰1、峰2（梓醇）峰高明显高于SD。

图2 混合对照品和QHP 样品的HPLC 图Fig.2 HPLC of mixed reference substances and QHP sample

2.3 统计学分析

为了进一步明确XD、XG、SD 化学成分的差异，采用系统聚类分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法-判别分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA）对XD、XG、SD 进行分析。

2.3.1 HCA 以QHP 样品的19 个共有峰峰面积为原始数据，采用SPSS 19.0 软件对数据进行HCA，采用Ward 法，以平方欧氏（Euclidean）距离为分类依据，得聚类树状图见图3。当距离为4 时，QHP样品可分为3 类，XD1～XD10、XG1～XG10、SD1～SD10 分别聚为一类，表明以不同入药形式制备的QHP 内在质量存在差别；当距离为10 时，QHP 样品被分为2 类，XD1～XD10 和XG1～XG10 聚为一类，SD1～SD10 聚为一类，表明2 个样品组之间存在更大差异。

图3 30 批QHP 样品HCA 树状图Fig.3 Dendrogram of HCA for 30 batches of QHP

2.3.2 PCA 将QHP 样品19 个共有峰峰面积导入SIMCA-P 14.1 软件中，采用非监督模式识别方法PCA 来观察样品的自然聚集。模型拟合的3 个主成分对原始资料的解释率分别为64.769%、13.389%、6.616%，3 者累积贡献率达到84.773%＞60%，表明模型预测良好。PCA 得分图见图4。可以看出，XD（XD1～XD10）、XG（XG1～XG10）、SD（SD1～SD10）分别聚为3 组，分类结果与地黄不同入药形式密切相关，说明地黄不同入药形式制QHP 在成分上的差异可以通过指纹图谱的差异来体现。

图4 30 批QHP 样品的PCA 得分图Fig.4 PCA score plot for 30 batches of QHP

2.3.3 OPLS-DA 为了进一步研究造成XD、XG、SD 差异的主要化学成分，采用SIMCA-14.1 软件对样品进行有监督模式的OPLS-DA，建立的模型稳定可靠，散点得分图见图5。图中XD、XG、SD 明显聚为3 类，该结果验证了HCA 和PCA 结果。变量重要性投影（variable importance projection，VIP）值见图6，以VIP＞1 为标准，得到8 个差异化学成分，分别为色谱峰1、6、15（表小檗碱）、3、4、2（梓醇）、16、9，提示这些成分对区分XD、XG、SD的贡献较大。

图5 30 批QHP 样品OPLS-DA 得分图Fig.5 OPLS-DA score plot for 30 batches of QHP

图6 QHP HPLC 指纹图谱中19 个共有峰的VIP 得分图Fig.6 VIP score plot of 19 common peaks in HPLC fingerprints of QHP

2.4 环烯醚萜苷类、黄连碱类成分含量测定

2.4.1 色谱条件 同“2.2.1”项。

2.4.2 对照品溶液的制备 同“2.2.2”项。

2.4.3 供试品溶液的制备 同“2.2.3”项。

2.4.4 线性关系考察 精密吸取“2.2.2”项下方法制备的混合对照品溶液0.2、0.4、1.0、2.0、3.0 mL，分别置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，分别以梓醇、益母草苷、黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马丁质量浓度为横坐标（X），以对应的峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，进行线性回归，得到各成分的回归方程、相关系数（r）及线性范围分别为梓醇Y＝7 049 243.43X－17 669.73，r＝0.999 6，线性范围60.0～906.0 μg/mL；益母草苷Y＝2 410 724.04X＋8 887.17，r＝0.999 1，线性范围10.0～156.0μg/mL；黄连碱Y＝40 608 328.57X－105 142.43，r＝0.999 9，线性范围11.0～160.0 μg/mL；表小檗碱Y＝57 505 210.05X－121 178.90，r＝0.999 8，线性范围11.0～171.0 μg/mL；药根碱Y＝44 025 436.50X－17 613.58，r＝0.999 5，线性范围10.0～153.0μg/mL；小檗碱Y＝47 708 886.24X＋262 093.47，r＝0.999 6，线性范围91.0～1 368.0 μg/mL；巴马丁Y＝2 410 724.04X＋8 887.17，r＝0.999 1，线性范围21.0～309.0 μg/mL。

2.4.5 精密度试验 取XD1 样品制备的供试品溶液，按照“2.2.1”项下色谱条件连续进样6 次，计算各待测成分峰面积的RSD，考察仪器的精密度。结果显示，7 个待测成分峰面积的RSD 均小于2.02%，表明仪器精密度良好。

2.4.6 稳定性试验 取XD1 样品制备的供试品溶液，于4 ℃条件下保存，分别于供试品溶液制备后0、2、4、8、12、24 h，按照“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算各待测成分峰面积的RSD。结果显示，7 个待测成分峰面积的RSD 均小于1.80%，结果表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.4.7 重复性试验 取XD1 样品6 份，按“2.2.3”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件依次进样测定，计算各待测成分质量分数的RSD。结果显示，7 个待测成分质量分数的RSD 均小于2.12%，表明该方法的重复性较好。

2.4.8 加样回收率试验 取已测定各指标成分含量的XD1 样品9 份，每份约0.25 g，精密称定，分3组，分别按QHP 样品中梓醇、益母草苷、黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马丁质量分数的50%、100%、150%加入相应对照品，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算QHP 样品中7 种指标成分的加样回收率及其RSD。结果7 种指标成分的平均加样回收率为97.64%～99.71%，RSD 为0.74%～1.83%，均小于3%。

2.4.9 样品测定 取表1 中的30 批QHP 样品，分别按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算各样品中7 种指标成分的含量。混合对照品溶液和QHP 供试品溶液的色谱图见图2，含量测定结果见表3、4。

表3 30 批QHP 样品中2 种环烯醚萜苷类成分、5 种生物碱类成分和5 种糖类成分含量测定结果Table 3 Determination results of two iridoid glycosides, five alkaloid components, and five carbohydrate components in 30 batches of QHP

由表3 可知，QHP 中环烯醚萜苷类成分梓醇和益母草苷总含量顺序为XG＞XD＞SD；5 种黄连碱类成分总含量顺序为SD＞XD＞XG。由表4 可知，10 批XD 中梓醇的均值为5.743 mg/g，益母草苷的均值为3.511 mg/g，黄连碱的均值为9.256 mg/g；表小檗碱的均值为1.135 mg/g，药根碱的均值为1.471 mg/g；小檗碱的均值为26.092 mg/g，巴马丁的均值为5.176 mg/g；10 批XG 中梓醇的均值为7.178 mg/g，益母草苷的均值为5.122 mg/g，黄连碱的均值为8.951 mg/g；表小檗碱的均值为1.043 mg/g，药根碱的均值为1.391 mg/g；小檗碱的均值为24.496 mg/g，巴马丁的均值为5.201 mg/g；10 批SD 中梓醇的均值为3.154 mg/g，益母草苷的均值为1.330 mg/g，黄连碱的均值为10.705 mg/g；表小檗碱的均值为1.446 mg/g，药根碱的均值为1.638 mg/g；小檗碱的均值为28.794 mg/g，巴马丁的均值为5.795 mg/g。

表4 2 种环烯醚萜苷类成分、5 种生物碱类成分和5 种糖类成分含量差异性分析 (±s, n = 10)Table 4 Analysis of differences of content in two iridoid glycosides, five alkaloid components, and five carbohydrate components (±s, n = 10)

表4 2 种环烯醚萜苷类成分、5 种生物碱类成分和5 种糖类成分含量差异性分析 (±s, n = 10)Table 4 Analysis of differences of content in two iridoid glycosides, five alkaloid components, and five carbohydrate components (±s, n = 10)

纵向比较具有相同字母的两组差异无统计学意义（P＜0.05）。there was no statistically significant difference between the two groups with the same letters in the longitudinal comparison (P < 0.05).

样品 质量分数/(mg∙g−1)梓醇 益母草苷 黄连碱 表小檗碱 药根碱 小檗碱XD 5.743±0.159b 3.511±0.104b 9.256±0.145b 1.135±0.009b 1.471±0.036b 26.092±0.108b XG 7.178±0.545a 5.122±0.106a 8.951±0.301b 1.043±0.017c 1.391±0.008c 24.496±0.564c SD 3.154±0.262c 1.330±0.077c 10.705±0.538a 1.446±0.060a 1.638±0.024a 28.794±1.125a样品 质量分数/(mg∙g−1)巴马丁 果糖 葡萄糖 蔗糖 棉子糖 水苏糖XD 5.176±0.087b 7.158±0.582b 5.332±0.202b 36.528±0.911b 16.204±0.648a 120.974±1.280a XG 5.201±0.090b 4.982±0.264c 5.198±0.160b 38.845±0.558a 14.161±0.452b 116.240±1.439b SD 5.795±0.232a 8.319±0.538a 5.543±0.118a 32.660±0.920c 12.228±0.267c 100.980±1.447c

对XD、XG 和SD 中7 种成分含量进行统计学分析，SD 与XD、XG 相比7 种成分含量均有显著性差异（P＜0.05）。

2.5 糖类成分含量测定

2.5.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Zorbax NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为水-乙腈（32∶68）；体积流量0.8 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL。ELSD 参数：气体体积流量2.8 L/min，漂移管温度85.0 ℃，增益1。

2.5.2 对照品溶液的制备 取果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖对照品适量，精密称定，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，得到质量浓度分别为1.590、2.710、11.150、7.440、54.980 mg/mL 的混合对照品溶液。

2.5.3 供试品溶液的制备 取QHP 样品0.2 g，精密称定，置100 mL 具塞锥形瓶中，精密加入60%色谱甲醇50 mL，称定质量，超声处理45 min（功率500 W、频率40 kHz），取出放冷，称定质量，补足减失的质量，滤过，取续滤液2 mL，经0.22 μm的微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.5.4 线性关系考察 精密吸取“2.5.2”项下混合对照品溶液0.10、0.50、1.00、1.25、2.50 mL，分别置于10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，分别以果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖质量浓度的对数为横坐标（X），以对应的峰面积的对数为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得到各成分的回归方程、相关系数（r）及线性范围分别为果糖Y＝0.767X＋2.740，r＝0.999 3，线性范围16.0～238.0 μg/mL；葡萄糖Y＝0.854X＋2.895，r＝0.999 2，线性范围27.0～406.0 μg/mL；蔗糖Y＝1.062X＋1.641，r＝0.999 5，线性范围111.0～1 673.0 μg/mL；棉子糖Y＝1.101X＋1.278，r＝0.999 9，线性范围74.0～1 116.0 μg/mL；水苏糖Y＝3.078X－12.00，r＝0.999 2，线性范围550.0～8 247.0 μg/mL。

2.5.5 精密度试验 取XD1 样品制备的供试品溶液，按照“2.5.1”项下色谱条件连续进样6 次，计算各待测成分峰面积的RSD，考察仪器的精密度。结果显示，5 个待测成分峰面积的RSD 均小于2.76%，表明仪器精密度良好。

2.5.6 稳定性试验 取XD1 样品制备的供试品溶液，4 ℃条件下保存，分别于供试品溶液制备后0、2、4、8、12、24 h，按照“2.5.1”项下色谱条件进样测定，计算各待测成分峰面积的RSD。结果显示，5 个待测成分峰面积的RSD 均小于1.86%，表明供试品溶液在24 h 内稳定性良好。

2.5.7 重复性试验 取XD1 样品6 份，按“2.5.3”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件依次进样分析，计算各待测成分质量分数的RSD。结果显示，5 个待测成分质量分数的RSD 均小于3.44%，表明该方法的重复性较好。

2.5.8 加样回收率试验 取已测定各指标成分含量的XD1 样品9 份，每份约0.25 g，精密称定，分3组，分别按QHP 样品中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖质量分数的50%、100%、150%加入对照品，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，计算QHP 样品中5 种成分的加样回收率及其RSD。结果5 种成分的平均加样回收率为 98.57%～99.40%，RSD 为0.80%～1.56%，均小于3%。

2.5.9 样品测定 取表1 中的30 批QHP 样品，分别按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件进样测定，计算样品中5 种糖类成分的含量。混合对照品溶液和供试品溶液的色谱图见图7，含量测定结果见表3。由表3 可知，5 种糖类成分含量总值顺序为XD＞XG＞SD。由表4 可知，10 批XD 中果糖含量的均值为7.158 mg/g，葡萄糖的均值为5.332 mg/g，蔗糖的均值为36.528 mg/g，棉子糖的均值为16.204 mg/g，水苏糖的均值为120.974 mg/g；10 批XG 中果糖含量的均值为4.982 mg/g，葡萄糖的均值为5.198 mg/g，蔗糖的均值为38.845 mg/g，棉子糖的均值为14.161 mg/g，水苏糖的均值为116.240 mg/g；10 批SD 中果糖含量的均值为8.319 mg/g，葡萄糖的均值为5.543 mg/g，蔗糖的均值为32.660 mg/g，棉子糖的均值为12.228 mg/g，水苏糖的均值为100.980 mg/g。其中，棉子糖和水苏糖的含量均值顺序为XD＞XG＞SD，与5种糖含量总值一致，而果糖、葡萄糖的含量均值顺序为SD＞XD＞XG，蔗糖的含量均值顺序为XG＞XD＞SD。对XD、XG 和SD 中5 种糖类成分含量进行统计学分析，SD 与XD、XG 相比5 种糖类成分含量均有显著性差异（P＜0.05）。

图7 混合对照品 (A) 和XD1 样品 (B) 的HPLC 图Fig.7 HPLC of mixed reference substances (A) and XD1 sample (B)

3 讨论

3.1 色谱条件的选择

考察了甲醇-0.1%磷酸水、甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氢钾、甲醇-0.02 mol/L 磷酸二氢钾、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.05 mol/L 磷酸二氢钾、乙腈-0.02 mol/L 磷酸二氢钾6 个流动相系统，结果发现以甲醇-0.02 mol/L 磷酸二氢钾为流动相，色谱峰的分离度较好，且基线平稳。考察不同柱温（25、30、35 ℃）、不同波长（203、210、230、280、354 nm）条件下检测、不同体积流量（0.6、0.8、1.0 mL/min）、不同进样量（5、10、20 μL），发现柱温35 ℃、检测波长（0～25 min，203 nm；25～80 min，280 nm）、体积流量0.8 mL/min、进样量5 μL 时，供试品溶液中各色谱峰均有较好的分离。

3.2 XD、XG、SD 的质量分析

本研究采用HPLC 建立了地黄不同入药形式制QHP 的HPLC 指纹图谱，30 批样品具有较高相似度。对HPLC 指纹图谱进行差异分析，可知XD、XG、SD 的HPLC 色谱图峰数目无明显区别，而XD 和XG 中峰1、2（梓醇）峰高明显高于SD。采用HPLC 指纹图谱结合化学计量学分析，可以将黄连丸样品分为XD、XG、SD 3 类，并确定1、6、15（表小檗碱）、3、4、2（梓醇）、16、9 色谱峰对区分地黄不同入药形式制QHP 的贡献较大。

含量测定研究中，通过测定QHP 中环烯醚萜苷类成分梓醇、益母草苷，发现梓醇和益母草苷总含量顺序为XG＞XD＞SD。测定生物碱类成分黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马丁的含量发现，5 种黄连碱类成分总含量顺序为SD＞XD＞XG。测定5 种糖类成分发现，5 种糖类成分含量总值顺序为XD＞XG＞SD，棉子糖和水苏糖的含量均值顺序为XD＞XG＞SD。统计学分析结果显示，SD 与XD、XG 相比2 种环烯醚萜苷类、5 种生物碱类、5种糖类成分含量均有显著性差异。分析含量测定结果，发现XD、XG 中梓醇、益母草苷、棉子糖、水苏糖含量较高，XD、XG 中生物碱类成分含量略低于SD。其中梓醇具有抗炎、降糖等药理作用，棉子糖和水苏糖是地黄低聚糖，主要具有补血、降血糖等药理活性[14]。研究表明，黄连单独使用治疗2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠致死率较黄连丸高[17]，推测可能与黄连中的生物碱类成分有关，其可能原因是黄连配伍地黄后，地黄中梓醇等苷类成分及糖类成分的存在对生物碱类成分溶出存在抑制作用，因此，鲜地黄用于制备QHP质量更好，考虑到鲜地黄汁不易储存等问题，实际应用中可以使用鲜干地黄片来制备黄连丸。下一步可设计临床药理实验探究地黄不同入药形式制QHP 的药效差异并对梓醇和地黄寡糖配伍黄连治疗糖尿病展开研究。

综上所述，指纹图谱作为一种中药质量控制模式，可以结合化学计量学对中药成分进行有效的分析，并且与多成分含量测定相结合进一步达到中药质量评价[20]。本研究采集鲜地黄，创新地将地黄不同入药形式与黄连配伍制备黄连丸，研究结果揭示了XD、XG、SD 中有效成分含量差异，为鲜干地黄片用于制备QHP 提供科学的参考依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突