土木香内酯抗病毒作用的体内外研究

李艺颖，初英杰#，孔令东，谢 芳，何昱廷，刘 霞，李俊良，罗 政，周义翔，王 遥*

1.北京中医药大学生命科学学院，北京 100029

2.北京中医药大学中药学院，北京 100029

土木香是菊科植物土木香InulaheleniumL.的干燥根，为蒙医常用清热类药，收录于《中国药典》2020 年版、《本草纲目拾遗》等[1]，其味苦、甘、辛，性平，具有解巴达干热、清赫依血相讧、开胃止痛、温中消食的功效，并作为多种蒙药复方中主药，用于瘟疫热症的治疗。如四味土木香散为治疗瘟病热症的经典方和基础方，于1977 年被载入《中国药典》[2-5]。该方清瘟解表，用于瘟病初期发冷发热、头痛咳嗽、咽喉肿痛的治疗。土木香内酯是从土木香中提取出的倍半萜烯内酯类小分子化合物，是《中国药典》2020 年版中规定的土木香主要的药效和质量评价成分，分子式为C15H20O2。现代药理学研究表明，土木香内酯对细菌、真菌具有明显的抵抗活性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌具有较佳的抑菌作用；土木香内酯能够通过抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路发挥抗炎功能。然而，作为土木香主要活性成分的土木香内酯，对其临床相关的抗病毒感染作用与机制的研究仍未见报道，很大程度上限制了土木香及其活性成分药用价值的提升。

抗病毒天然免疫反应是宿主抵御病毒入侵的第一道防线[6]。病毒释放基因组进入细胞质，宿主细胞通过模式识别受体（pattern recognition receptor，PRR）识别并结合病原体相关分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP），将病毒入侵信号传给接头蛋白（MAVS/STING），进而激活转录因子干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）和IRF7 转位入核，启动I 型干扰素（type I interferon，IFN-I）的转录和表达。环鸟苷酸-腺苷酸合酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）-STING 信号轴由第二信使cGAS 和干扰素基因STING 的环鸟苷酸-腺苷酸受体刺激物组成，可检测致病DNA，以触发先天免疫反应，涉及针对微生物感染的强IFN-I 反应[7]。在细胞质中，视黄酸诱导基因-I 样受体（retinoic acid-inducible gene I-like receptor，RLR）、视黄酸诱导基因-I（retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）和黑色素瘤分化相关基因5（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5）感知与病毒感染相关的非典型RNA[8-9]，通过接头分子MAVS触发信号级联反应，翻译产生IFN-I，干扰素分泌到细胞外，与细胞膜表面的干扰素受体[I 型干扰素受体1（type I interferon receptor 1，IFNAR1）、I 型干扰素受体2（type I interferon receptor 2，IFNAR2）]结合，激活JAK 激酶（Janus kinase，JAK）-信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）信号通路，并诱导大量干扰素刺激基因（interferon stimulated genes，ISGs）表达，这些ISGs 可在病毒生命周期的各个阶段包括入侵、复制、装配和释放发挥广泛的抗病毒作用[10]。

本研究通过构建多种病毒感染的细胞模型，发现土木香内酯对水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）、甲型流感病毒（influenza A virus，H1N1）、脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）等病毒复制的体外抑制作用。此外，通过构建小鼠H1N1 病毒滴鼻感染模型，发现土木香内酯能够提高感染小鼠的存活率，降低肺组织中H1N1 的病毒载量。本研究利用分子生物学及免疫学研究手段，初步阐明土木香内酯通过活化抗病毒天然免疫信号通路抵抗病毒复制的免疫药理机制。为土木香及蒙药四味土木香散的抗病毒临床应用提供了重要的科学数据支撑，为相关药物未来的科学开发打下了坚实的基础。

1 材料

1.1 细胞与病毒

人肺上皮细胞系A549 细胞购自美国ATCC 公司；IFNAR1 敲除A549 细胞（Ifnar1−/−A549）由本实验室构建[11]；小鼠原代成纤维MEF 细胞来源于本实验室冻存；VSV（印第安纳株）、VSV-GFP、H1N1（PR8 株）、EMCV 均来自本实验室，病毒扩增后置于−80 ℃保存。

1.2 动物

SPF 级雄性C57BL/6 小鼠，6～8 周，体质量18～20 g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司，生产许可证SCXK（京）2019-0010。动物于室温（23±2）℃、相对湿度40%～70%、昼夜交替照明的环境中饲养，自由进食饮水。动物实验经北京中医药大学实验动物伦理委员会批准（批准号BUCM-2023120501-4152）。

1.3 药品与试剂

土木香内酯（质量分数≥98.0%，批号PS1852-0025）购自成都普思生物科技股份有限公司；达菲®磷酸奥司他韦胶囊（以奥司他韦计75 mg/粒，批号0221906016）购自宜昌长江药业有限公司；二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批号D4540）购自美国Sigma 公司；IFN 刺激性DNA（interferon stimulatory DNA，ISD，批号tlrl-isdn）、聚乙烯亚胺（PEI，批号 BMS1003-A）、Trizol 试剂（批号15596018）均购自美国Invitrogen 公司；Evo M-MLV RT Kit（批号AG11711）、SYBR®Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit（批号AG11701）购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；DMEM 高糖培养基（批号C11995500CP）、青霉素-链霉素（10 000 U/mL，批号15140-122）、胎牛血清（批号2358184P）购自美国Gibco 公司；0.25%胰蛋白酶/EDTA 细胞消化液（批号T1300）购自北京索莱宝科技有限公司；CCK-8 细胞增殖-毒性检测试剂盒（批号CK04）购自东仁化学科技（上海）有限公司；VSV-G tag 重组抗体（ 批号 ab183497 ）、H1N1 Influenza A virus Nucleocapsid protein（H1N1-NP）抗体（批号104870）购自英国Abcam 公司；超敏ELC 发光液（批号WBKLS0500）购自美国Millipore 公司；HRP 标记的羊抗兔IgG 二抗（批号M21002）购自艾比玛特医药科技（上海）有限公司。

1.4 仪器

CytoFLEX 流式细胞仪（美国Beckman 公司）；CFX96 型荧光定量PCR 仪、T100 型PCR 仪、PowerPac 型基础电泳仪（美国Bio-Rad 公司）；NANODROP ONEc 型分光光度计、Sorvall™Legend™Micro 21R 型微量离心机、300 Series A2 型生物安全柜、Heracell 150i 型CO2培养箱（美国Thermo 公司）；SpectraMax i3x 型多功能酶标仪[美谷分子仪器（上海）有限公司]；Mill-Q 超纯水仪（美国Millipore 公司）；ZHCH-C1115B 型超净工作台（上海智城分析仪器制造有限公司）；DK-8D 型电热恒温水槽（上海一恒科技有限公司）；SKL180-Pro 型数控线性摇床[大龙兴创实验仪器（北京）股份公司]；EPS-300 型数显式稳压稳流电泳仪（天能公司）；SCl-VS 型可调式混匀仪（美国Scilogex 公司）；1CKX53 型倒置显微镜（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 药物的配制

取土木香内酯25 mg，加入1.076 1 mL DMSO，充分振荡，37 ℃超声60 min 后即为100 mmol/L 母液，分装后储存于−80 ℃备用。根据具体使用浓度计算所需母液体积，按照一定比例用DMEM 完全培养基稀释至使用浓度，充分涡旋振荡后，加入细胞使用。

2.2 细胞活力测定

A549细胞以每孔2.5×104个的密度接种于96孔板，培养过夜使细胞完全贴壁；配制0.078 125、0.156 250、0.312 500、0.625 000、1.250 000、2.500 000、5.000 000、10.000 000、20.000 000、40.000 000、80.000 000 μmol/L 的土木香内酯溶液加入细胞中，同时设置仅加入DMEM 的空白组（不含细胞）和0.1% DMSO溶剂对照组（含细胞），每孔设置3 个复孔，于5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养；培养24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 试剂孵育30 min，使用酶标仪测定450 nm 处吸光度（A）值，计算细胞存活率。

细胞存活率＝(A给药－A空白)/(A对照－A空白)

2.3 流式细胞术检测土木香内酯对A549 细胞中VSV-GFP 病毒复制的影响

A549 细胞以每孔1.2×105个密度接种于24 孔板，培养过夜至细胞贴壁后，设置对照组、模型组和土木香内酯（5、10、20 μmol/L）组，除对照组外，VSV-GFP 以 0.05 的感染复数（multiplicity of infection，MOI）感染各组细胞[11]，同时加药共同孵育，对照组和模型组加入DMSO。孵育12 h 后用预冷PBS 清洗细胞2 次，加入100 μL 胰酶消化，收集细胞至流式管，采用流式细胞仪上机检测GFP 阳性细胞比例。

2.4 荧光显微镜检测土木香内酯对A549 细胞中VSV-GFP 病毒复制的影响

细胞接种、分组同“2.3”项，除对照组外，VSVGFP 以MOI＝0.1 感染各组细胞[11]，同时加药共同孵育，对照组和模型组加入DMSO。孵育24 h 后，采用荧光显微镜检测土木香内酯对VSV-GFP 的抑制作用。

2.5 qRT-PCR 检测土木香内酯对EMCV、H1N1 病毒mRNA 表达的影响

细胞接种、分组同“2.3”项，分别使用H1N1（MOI＝0.05）、EMCV（MOI＝3）感染细胞[11]，同时加药共同孵育。共同孵育12 h 后，收集细胞，加入Trizol 试剂提取总RNA 并合成cDNA，进行qRT-PCR分析，检测病毒基因的表达水平。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.6 Western blotting 检测土木香内酯对VSV-G 和H1N1-NP 蛋白表达的影响

收集不同浓度（5、10、20 μmol/L）土木香内酯和不同时间（0、8、12、16 h）处理后的病毒感染细胞蛋白，BCA 法测定蛋白浓度。蛋白样品经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至PVDF 膜，封闭后，分别加入VSV-G 抗体（1∶3 000）和H1N1-NP 抗体（1∶1 500），4 ℃孵育过夜；室温孵育二抗（1∶5 000），加入ECL 化学发光试剂，于凝胶成像仪中曝光显影。

2.7 土木香内酯对VSV-GFP、H1N1 和EMCV 病毒复制周期的影响

细胞接种同“2.3”项，过夜培养后，设置对照组、模型组和土木香内酯（5、10、20 μmol/L）组。土木香内酯使用病毒感染前预处理12 h、病毒吸附2 h 过程中、病毒吸附后3 种不同方式给药，加入VSV-GFP（MOI＝0.05）或H1N1（MOI＝0.05）或EMCV（MOI＝3）感染12 h，通过流式细胞术检测土木香内酯对VSV-GFP 病毒复制的影响，通过qRTPCR 检测土木香内酯对EMCV、H1N1 病毒复制的影响。

2.8 RNA 测序及转录组学分析

MEF 细胞接种于12 孔板，培养过夜后，加入DMSO（对照组）或20 μmol/L 土木香内酯处理12 h，收集细胞，加入Trizol 试剂提取RNA，然后反转录为 cDNA 进行测序。使用 Hieff NGS Ultima Dualmode mRNA Library Prep Kit for Illumina（Yeasen Biotechnology Co.，Ltd.）产生测序文库。文库在Illumina NovaSeq 平台上测序，产生150 bp 的成对端读数。使用Hisat2 工具软件与参考基因组进行映射，并获得每个样本中基因的原始表达值。使用edgeR 进行差异表达分析，错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.05 且|log2FC|＞1 的基因被认为是差异表达基因。

2.9 qRT-PCR 检测土木香内酯对ISGs mRNA 表达的影响

MEF 细胞以每孔1×105个的密度接种于12 孔板，培养过夜后，加入DMSO（对照组）或5、10、20 μmol/L 土木香内酯处理12 h，收集细胞，加入Trizol 试剂提取总RNA 并合成cDNA，进行qRTPCR 分析，检测干扰素α1（interferon α1，Ifna1）、干扰素β1（interferon β1，Ifnb1）、干扰素诱导蛋白1（interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1，Ifit1）、Isg15的mRNA 表达。引物序列见表1。

2.10 土木香内酯对Ifnar1−/− A549 细胞中VSVGFP、H1N1、EMCV 病毒复制的影响

A549 细胞和Ifnar1−/−A549 细胞分别以每孔1.2×105个密度接种于24 孔板，培养过夜至细胞贴壁后，设置对照组、模型组和土木香内酯（5、10、20 μmol/L）组，使用VSV（MOI＝0.05）、EMCV（MOI＝3）、H1N1（MOI＝0.05）感染细胞[11]，同时加药共同孵育。共同孵育12 h 后，通过流式细胞术检测A549 细胞和Ifnar1−/−A549 细胞中给予土木香内酯对GFP 阳性细胞比率的影响，或者通过qRTPCR 检测这2 种细胞中给予土木香内酯对H1N1 和EMCV 病毒复制的影响。

2.11 土木香内酯对流感病毒感染小鼠的保护作用

将小鼠随机分为对照组、模型组、土木香内酯（30 mg/kg）组和磷酸奥司他韦胶囊（40 mg/kg）组，每组10 只。小鼠适应性饲养1 周后，除对照组外，其余小鼠于实验第0 天滴鼻接种H1N1 病毒（50 μL/只）建立流感病毒感染小鼠模型。各给药组ig 相应药物，对照组和模型组ig 生理盐水，1 次/d，连续14 d。给药组小鼠第7 天每组随机选取5 只小鼠处死，采集小鼠肺组织，经Trizol 法提取总RNA，qRT-PCR检测肺组织中H1N1的mRNA 表达水平。统计各组剩余小鼠存活天数及死亡数，计算存活率。

2.12 统计学分析

数据用GraphPad Prism 软件进行可视化处理，以±s表示，两组样本间通过双尾非配对t检验进行比较，多组样本间通过单因素方差分析进行比较。

3 结果

3.1 土木香内酯对A549 细胞存活率的影响

通过CCK-8 法检测不同浓度的土木香内酯处理24 h 后，对A549 细胞存活率的影响，计算得到半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）为79.63 µmol/L（图1）。后续选取无明显细胞毒性的低、中、高浓度（5、10、20 μmol/L）进行实验。

图1 土木香内酯结构式 (A) 及其对A549 细胞存活率 (B) 的影响 (±s, n = 3)Fig.1 Structure of alantolactone (A) and its effect on survival rate (B) of A549 cells (±s, n = 3)

3.2 土木香内酯对VSV 病毒复制的影响

如图2-A 所示，与对照组比较，VSV-GFP 感染引起了A549 细胞GFP 阳性细胞比例的增加（P＜0.001）；与模型组比较，土木香内酯呈剂量相关性地减少了GFP 阳性细胞的比例（P＜0.001），尤其在浓度为20 μmol/L 时抑制病毒复制的效果显著，GFP阳性细胞即被感染细胞的比例降低至5.74%。随后，使用荧光显微镜检测了土木香内酯对VSV-GFP 感染的细胞绿色荧光强度的影响，如图2-B 所示，与模型组比较，土木香内酯可以显著抑制VSV-GFP 的荧光强度（P＜0.001）；此外，检测了土木香内酯对野生型VSV 的抑制作用，如图2-C、D 所示，与模型组比较，土木香内酯在剂量和时间梯度上降低了VSV-G 蛋白表达。表明土木香内酯能够在细胞水平有效抑制VSV 的复制。

图2 土木香内酯对A549 细胞中VSV 病毒复制的抑制作用 (±s, n = 3)Fig.2 Inhibition of alantolactone on VSV replication in A549 cells (±s, n = 3)

3.3 土木香内酯对EMCV、H1N1 病毒复制的影响

为了探究土木香内酯对不同病毒的抑制作用，利用EMCV、H1N1 感染A549 细胞，同时加入土木香内酯处理12 h。通过qRT-PCR 技术检测病毒基因拷贝情况，如图3-A、B 所示，与对照组比较，模型组病毒基因的拷贝数均显著升高（P＜0.001）；与模型组比较，土木香内酯组病毒基因的拷贝数均显著降低（P＜0.001）。如图3-C 所示，土木香内酯在剂量和时间梯度上明显抑制了H1N1-NP 蛋白表达，表明土木香内酯显著抑制EMCV、H1N1 病毒的复制。

图3 土木香内酯对A549 细胞中H1N1、EMCV 病毒复制的抑制作用 (±s, n = 3)Fig.3 Inhibition of alantolactone on H1N1, EMCV replication in A549 cells (±s, n = 3)

3.4 土木香内酯作用于VSV-GFP、EMCV、H1N1病毒复制周期的多个阶段

为了探究土木香内酯对VSV-GFP、EMCV、H1N1 病毒复制周期不同阶段的影响，设置了不同的加药方式（图4-A），分别对细胞进行了预处理、病毒吸附过程中给药、病毒吸附后给予土木香内酯。结果表明，预处理给予土木香内酯处理方式下，与模型组比较，土木香内酯预给药组可以抑制VSVGPF、EMCV、H1N1 病毒复制（P＜0.01、0.001，图4-B、E、H）；在病毒吸附的过程中给药时，与模型组比较，病毒复制水平没有显著性变化（图4-C、F、I）；在病毒吸附后给药，与模型组比较，土木香内酯可以显著抑制VSV-GPF、EMCV、H1N1 病毒复制（P＜0.01、0.001，图4-D、G、J）。上述结果表明，土木香内酯对VSV-GFP、EMCV 和H1N1 病毒的吸附过程没有影响，而预处理或吸附后给药可以显著抑制VSV-GFP、EMCV、H1N1 病毒复制。

图4 土木香内酯在病毒复制周期不同阶段给药对VSV-GFP、EMCV、H1N1 病毒复制的影响 (±s, n = 3)Fig.4 Effect of alantolactone administration at different stages of virus replication cycle on VSV-GFP, EMCV, H1N1 virus replication (±s, n = 3)

3.5 土木香内酯诱导抗病毒天然免疫信号通路激活

为了探究土木香内酯抵抗病毒复制的分子机制，对土木香内酯处理的MEF 细胞进行了转录组学测序分析。如图5-A 所示，与对照组比较，土木香内酯处理诱导了549 个差异表达基因，其中包含367 个上调基因、182 个下调基因。值得注意的是，几种与抗病毒IFN-I 通路相关的基因被显著上调，如Ifna1、Ifnb1、Ifit44、Isg15、Ifit1等。通过对差异基因进行KEGG 通路富集分析，结果显示病毒感染和抗病毒天然免疫相关的通路被显著富集，主要包括EB 病毒感染、甲流病毒感染和Toll 样受体信号通路等（图5-B）。基于基因表达值的GSEA 分析发现（图5-C），土木香内酯处理组显著富集到与抗病毒天然免疫反应相关的IFN-α 信号通路。上述结果提示，土木香内酯可能通过激活细胞内的抗病毒天然免疫信号通路，发挥抗病毒功能。

图5 土木香内酯处理细胞的生物信息学分析 (A)、KEGG 通路分析 (B) 和GSEA (C)Fig.5 Bioinformatics analysis of alantolactone-treated cells (A), KEGG pathway analysis (B) and GSEA (C)

3.6 土木香内酯通过激活IFN-I 信号通路发挥抗病毒作用

药物处理细胞的生物信息学分析结果提示，土木香内酯的抗病毒功能与宿主抗病毒天然免疫应答的核心信号通路IFN-I 信号通路高度相关。因此，检测了土木香内酯处理MEF 细胞中ISGs（Ifna1、Ifnb1、Ifit1、Isg15）的表达情况。如图6 所示，与对照组比较，土木香内酯处理显著诱导Ifna1、Ifnb1、Ifit1、Isg15的mRNA 表达水平升高（P＜0.001）。表明土木香内酯单独药物处理有效促进IFN-I 的表达，并诱导干扰素诱导基因Ifit1、Isg15等的表达。

图6 土木香内酯对MEF 细胞IFN-I 通路中相关基因表达的影响 (±s, n = 3)Fig.6 Effect of alantolactone on expressions of related genes in IFN-I pathway of MEF cells (±s, n = 3)

3.7 Ifnar1−/− A549 细胞中土木香内酯对病毒复制的影响

IFNAR1 是细胞表面IFN 的重要受体，其与IFN结合后可激活下游JAK-STAT 信号通路。因此，利用IFNAR1 敲除A549 细胞（Ifnar1−/−A549）探究土木香内酯发挥抗病毒作用与IFN-I 信号通路的依赖关系。qRT-PCR 结果显示，与野生型细胞（A549细胞）相比，在Ifnar1−/−A549 细胞中土木香内酯对VSV、EMCV 和H1N1 病毒的抑制功能被显著削弱。上述结果表明，土木香内酯的抗病毒功能部分依赖IFN-I 信号通路（图7）。

图7 土木香内酯对Ifnar1−/− A549 细胞中VSV、EMCV、H1N1 病毒复制的影响 (±s, n = 3)Fig.7 Effect of alantolactone on VSV, EMC and H1N1 virus replication in Ifnar1−/− A549 cells (±s, n = 3)

3.8 土木香内酯对流感病毒感染小鼠的保护作用

如图8-A 所示，模型组小鼠在感染后第8 天开始出现死亡，到第10 天全部死亡。而磷酸奥司他韦胶囊组和土木香内酯组的生存率分别为60%和80%，表明土木香内酯提高流感病毒感染小鼠的生存率。如图8-B 所示，在病毒感染后第7 天检测小鼠肺组织流感病毒载量，与模型组比较，土木香内酯给药组小鼠肺脏中H1N1病毒mRNA 表达显著降低（P＜0.001），表明土木香内酯在体内抑制流感病毒的复制。

图8 土木香内酯对流感病毒感染小鼠的保护作用 (±s, n = 5)Fig.8 Protective effect of alantolactone on influenza virus-infected mice (±s, n = 5)

4 讨论

土木香是菊科植物土木香I.heleniumL.的干燥根，又名黄花菜，始载于《本草图经》，土木香性微温，味辛苦，无毒，入肺、肝、脾三经。有健脾和胃、行气止痛之效，临床用于治胸腹胀满疼痛、呕吐泄泻、痢疾、疟疾等。土木香中主要的化学成分是倍半萜内酯类，包括土木香内酯、异土木香内酯、土木香醇、土木香酸、二氢土木香内酯等。其中土木香内酯和异土木香内酯是《中国药典》土木香质量评价的对照品成分[12]。土木香内酯的药理作用包括抗菌、抗炎、抗肿瘤、镇痛、保肝等[1,13-18]。然而，土木香内酯作为土木香中主要药效和质量评价成分，关于其临床应用、治疗由病毒感染引发的瘟疫热症的药理作用及机制研究匮乏，限制了土木香及其活性成分药用价值提升和药物研发。

VSV、H1N1 和EMCV 病毒是抗病毒研究中常用的RNA 模式病毒[19-22]，因此本研究利用流式细胞术、qRT-PCR 等技术证明了土木香内酯可在细胞水平抑制VSV-GFP、H1N1 和EMCV 病毒复制，并发现土木香内酯预处理和在病毒吸附后处理其抗病毒效应最优，这提示土木香内酯可能通过影响宿主细胞的细胞内因素发挥抗病毒功能。通过生物信息学分析结合qRT-PCR 验证土木香内酯单独处理可诱导IFN-I 编码基因Ifna1、Ifnb1表达，并同时诱导干扰素诱导基因Ifit1、Isg15表达，即土木香内酯可直接激活细胞IFN-I信号通路。接着在Ifnar1−/−A549细胞中证明土木香内酯抗病毒功能与IFN 通路的部分依赖关系。此外，土木香内酯在H1N1 感染的小鼠模型中表现出提升小鼠生存率、降低肺组织病毒载量的作用。

IFN 是对病毒感染的先天免疫反应的关键效应因子。通过结合IFNAR 诱导下游ISGs 的表达。这些ISGs基因能够抑制病毒复制和促进病毒清除[23]。本研究结果表明，药物处理细胞后抗病毒通路相关的基因包括Ifna1、Ifnb1、Ifi44、Isg15、Ifit1被显著上调。其中，IFIT 蛋白在人体内包含4 个家族成员（IFIT1、IFIT2、IFIT3 等）[24-25]，在病毒感染或IFNs诱导后，IFIT 家族蛋白能够与其他家族蛋白以及数种RNA 结合蛋白形成复合体，从而清除病毒[24]。ISG15 编码的蛋白ISG15 是一个类泛素蛋白，该家族蛋白能够与IFN 诱导的抗病毒因子如蛋白激酶R（protein kinase R，PKR）、三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP）酶MxA、HuP 家族结合将靶蛋白ISG化，从而促进这些抗病毒因子的表达活性[25]。

综上，本研究表明土木香内酯通过激活IFN-I通路诱导干扰素诱导基因表达，在体内外发挥抵抗病毒复制的作用。为土木香及蒙药四味土木香散的抗病毒研究提供扎实的科学数据支持，并为其临床应用提供重要的科学理论支撑。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突